陳芳，覃健峰，鄭德濱，袁紅艷，吳瓊※

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海 201400）

雉雞，學(xué)名環(huán)頸雉，俗稱(chēng)野雞、山雞。在動(dòng)物分類(lèi)學(xué)屬于鳥(niǎo)綱（Aves）雞形目（Gallinales）雉科（Phasianidae）雉屬（Phasianus）。雉雞在我國(guó)飼養(yǎng)較早，3 000年前殷商甲骨文中記載有“雉”字?！侗静菥V目》詳細(xì)記載了雉雞各部位的藥用價(jià)值[1,2]。在野生狀態(tài)下，雉雞分為30個(gè)亞種，其中在我國(guó)境內(nèi)分布有19個(gè)亞種，除西藏和海南外，全國(guó)各地均有分布。我國(guó)對(duì)雉雞大規(guī)模馴養(yǎng)和研究始于20世紀(jì)60年代，1981年獲得成功，自此雉雞人工養(yǎng)殖技術(shù)在全國(guó)范圍內(nèi)進(jìn)行了大規(guī)模的推廣普及。我國(guó)雉雞飼養(yǎng)業(yè)歷經(jīng)30多年的發(fā)展，從無(wú)到有，從小到大，得到了飛速的發(fā)展[3]。

‘申鴻七彩雉雞’（Shenhong pheasant）是2011年由上海欣灝珍禽育種有限公司聯(lián)合中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所等4家單位歷經(jīng)7年聯(lián)合選育的肉蛋兼有型雉雞新品種，2019年通過(guò)國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)審定?！犋櫰卟曙綦u’18周齡上市體重公雉達(dá)1 350 g、母雉雞達(dá)1 000 g，飼養(yǎng)56周齡日產(chǎn)蛋130個(gè)。與其他雉雞品種相比，生長(zhǎng)速度快、肉用性能好且產(chǎn)蛋多，中試結(jié)果體現(xiàn)了較強(qiáng)的適應(yīng)性，具有先進(jìn)的綜合生產(chǎn)性能，符合市場(chǎng)需求，具有廣闊的推廣前景。

線粒體基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，編碼基因內(nèi)不含內(nèi)含子，能夠獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，世代間無(wú)基因重組。線粒體嚴(yán)格遵循母系單性遺傳的特性，單一的一個(gè)樣本就能夠攜帶群體的全部基因，代表一個(gè)母系群體特征，通過(guò)少量的樣本就能夠?qū)θ后w的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面分析，而且結(jié)果可靠，有利于群體遺傳研究[4,5]?！犋櫰卟曙綦u’的線粒體全基因組序列目前還未見(jiàn)報(bào)道，本研究利用PCR測(cè)序方法，獲得‘申鴻七彩雉雞’線粒體全基因組全長(zhǎng)序列，并與其他雉雞序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，為‘申鴻七彩雉雞’種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本來(lái)自上海欣灝珍禽育種有限公司3層籠養(yǎng)的‘申鴻七彩雉雞’3個(gè)個(gè)體。翅靜脈采血，EDTA抗凝，充分混勻保存于﹣20℃冰箱備用。

1.2 血液DNA提取和鑒定

參照南京諾維贊生物科技股份有限公司的全血基因組DNA快速提取試劑盒（柱式），具體步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，DNA條帶為單一致密的樣品可作為后續(xù)試驗(yàn)材料，說(shuō)明DNA質(zhì)量較好且無(wú)降解。利用分光光度法檢測(cè)DNA濃度，樣品的OD260nm/OD280nm比值在1.6～1.8之間，則表明DNA純度較高。檢測(cè)合格后放置﹣20℃冰箱備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)線粒體DNA環(huán)狀雙鏈閉合的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，參照NCBI中已公布的雉雞線粒體基因組全序列（登錄號(hào)：FJ752430），Primer Premier 5.0和Oligo 6.0設(shè)計(jì)覆蓋雉雞線粒體全序列的引物，見(jiàn)表1，由上海生物工程有限公司合成。新合成引物需低速離心后，按照引物合成單上的說(shuō)明，用滅菌雙蒸水稀釋到20 m，室溫溶解3 h以上，然后﹣20℃保存。

表1 擴(kuò)增片段的PCR引物Table1 Primers for PCR

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)提取的DNA模板長(zhǎng)度進(jìn)行PCR，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化配置，并通過(guò)梯度PCR摸索合適的退火溫度及反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系為25L：2 Es Taq MasterMix 15L、上下游引物各0.5L，DNA模板1.0L，dd H2O 11.5L。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，5 min，變性94℃，30s，退火以實(shí)際摸索的溫度，30s，延伸72℃，60 s，再延伸72℃，5 min，循環(huán)數(shù)為35次。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）上進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。選取符合條件的PCR產(chǎn)物送往上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 使用Geneious軟件進(jìn)行雉雞線粒體全基因組序列注釋分析。

1.5.2 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，建進(jìn)化樹(shù)之前，使用Dambe 5進(jìn)行堿基替換飽和性分析，在核苷酸序列顯示未飽和的前提下，方可建樹(shù)[6]。使用jModelTest 2.1.7[7]計(jì)算似然值，基于BIC標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型選擇[8]，線粒體13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的最優(yōu)模型為HKY+I+G。使用Mega 7.0軟件采用最大似然法（Maximum Likelihood method,ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自舉檢驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

圖1 基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoretic analysis of genomic DNA

2.2‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組的序列分析

組裝注釋得到‘申鴻七彩雉雞’3個(gè)樣品的全線粒體基因組，3個(gè)樣品的線粒體基因組完全相同，全長(zhǎng)為16 685 bp。結(jié)構(gòu)均為典型的環(huán)狀雙鏈，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（ND1、ND2、COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND3、ND4L、ND4、ND5、CYTB和ND6）、2個(gè)rRNA（12S rRNA和16S rRNA）、22個(gè)tRNA和一個(gè)非編碼的控制區(qū)（D-Loop）。

‘申鴻七彩雉雞’13個(gè)蛋白編碼基因總長(zhǎng)度平均為11 369 bp，占整個(gè)基因組的68.13%，其中ND6由L鏈編碼，其余均由H鏈編碼。‘申鴻七彩雉雞’最長(zhǎng)的蛋白質(zhì)編碼基因是ND5，為1 818 bp，最短的是ATP8基因，為165 bp。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，密碼子規(guī)律同中國(guó)環(huán)頸雉?；蛑丿B有7處，總長(zhǎng)度為30 bp；基因間隔為20處，總長(zhǎng)度為52 bp；基因間無(wú)間隔和重疊有11處。

表2 ‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組基因定位和特征表Table 2 Gene locations of mitochondrial genome of'Shenhong pheasant'

續(xù)表2

2.3 rRNA和D-loop序列控制區(qū)

‘申鴻七彩雉雞’12S rRNA和16S rRNA長(zhǎng)度分別為966 bp和1 619 bp，占整個(gè)基因組的5.79%和9.70%。兩個(gè)rRNA位于tRNA-Phe和tRNA-Leu（UUR）之間，被tRNA-Val基因分隔開(kāi)。D-loop序列控制區(qū)位于tRNA-Phe和tRNA-Glu之間，序列長(zhǎng)為1 148 bp，占整個(gè)基因組的6.88%。

2.4 tRNA

tRNA基因共有22個(gè)，長(zhǎng)度為65～78 nt，tRNA全長(zhǎng)為1 541 bp，占整個(gè)基因組的9.24%。tRNA基因中最長(zhǎng)為tRNA-Trp，最短為tRNA-Ser（AGY）。tRNA均可以折疊形成三葉草結(jié)構(gòu)。

2.5‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組堿基組成特征

‘申鴻七彩雉雞’線粒體全基因組、蛋白質(zhì)編碼基因、tRNA、rRNA和D-Loop區(qū)堿基組成見(jiàn)表3。所有基因AT含量均大于CG含量，D-Loop區(qū)的AT含量最高，為60.02%，其次是含量為58.73%的tRNA，最低為PCG，含量55.33%。

表3 ‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組堿基組成Table 3 Base composition of mitochondrial genome of'Shenhong pheasant'

2.6‘申鴻七彩雉雞’與其他雉雞進(jìn)化關(guān)系

選擇NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）發(fā)布的7條雉雞線粒體全基因組序列，包括日本綠雉2條、環(huán)頸雉4條和甘肅亞種雉雞1條，與本研究的‘申鴻七彩雉雞’均提取13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因序列。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，10個(gè)雉雞種群分為兩支，‘申鴻七彩雉雞’和‘甘肅亞種雉雞’聚在一起。日本綠雉和環(huán)頸雉聚在一起（圖2和圖3）。

圖2 基于蛋白質(zhì)編碼基因的‘申鴻七彩雉雞’與雉雞進(jìn)化樹(shù)（ML）Fig.2 Electrophoretic analysis of genomic DNA

圖3 基于蛋白質(zhì)編碼基因的‘申鴻七彩雉雞’與雉雞進(jìn)化樹(shù)（NJ）Fig.3 Electrophoretic analysis of genomic DNA

3 討論

3.1 ‘申鴻七彩雉雞’線粒體基因組的大小和密碼子使用

‘申鴻七彩雉雞’的線粒體基因組與其他鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物相似，為環(huán)狀雙鏈DNA分子。線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用，作為起始密碼子，線粒體13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中9個(gè)基因使用ATG，ATG是動(dòng)物最常用的起始密碼子，2個(gè)基因使用ATA，NAD5基因使用ATA。在鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物中，NAD4L基因都使用GTG作為起始密碼子，GTG是真核生物線粒體基因組中特有的起始密碼子。作為終止密碼子，大多基因使用完整終止密碼子TAA、TAG和AGA，少數(shù)使用不完整終止密碼子T。李喜鳳[9]分析了環(huán)頸雉線粒體基因組全序列，全長(zhǎng)為16 692 bp，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因和一個(gè)非編碼控制區(qū)；環(huán)頸雉的控制區(qū)長(zhǎng)度為1 147 bp，可分為3個(gè)區(qū)：domain I～I(xiàn)II；本研究中‘申鴻七彩雉雞’的線粒體基因組結(jié)構(gòu)、堿基組成和基因排列順序均與雞形目其他物種相似。

3.2 基于線粒體編碼蛋白基因‘申鴻七彩雉雞’分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

吳瓊等[10]關(guān)于線粒體細(xì)胞色素b基因序列的研究顯示，日本綠雉單成一個(gè)系，‘中國(guó)環(huán)頸雉’‘蒙古雉雞’‘黑化雉雞’‘申鴻七彩雉雞’混在一支?！犋櫰卟曙綦u’是我國(guó)野生雉雞馴化后的中國(guó)山雞與上海本地飼養(yǎng)的山雞雜交形成的品種，上海本地山雞為90年代初我國(guó)從美國(guó)引進(jìn)的中國(guó)環(huán)頸雉，長(zhǎng)期飼養(yǎng)適應(yīng)本地條件而形成的雉雞種群。劉影[11]關(guān)于線粒體基因組全序列的研究顯示，‘美國(guó)七彩山雞’（中國(guó)環(huán)頸雉）來(lái)源于野生雉雞亞種，這與本研究中‘申鴻七彩雉雞’與‘甘肅亞種雉雞’互為姐妹群相一致。

4 結(jié)論

‘申鴻七彩雉雞’的線粒體DNA基因組全長(zhǎng)為16 685 bp，為典型的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其線粒體基因組結(jié)構(gòu)、堿基組成和基因排列順序均與雞形目其他物種相似?！犋櫰卟曙綦u’與‘甘肅亞種雉雞’互為姐妹群。