趙永強，吳艷虹，章秀婷，韋韜，彭倩文，任二軍，叢麗，邵西群※

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 長春 130112；2.吉林省特種經濟動物分子生物學重點實驗室，吉林 長春 130112；3.河北省毛皮動物養(yǎng)殖技術創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050041）

水貂阿留申病（aleutian disease,AD）是由水貂阿留申病毒（aleutian mink disease virus,AMDV）感染引起的慢性消耗性疾病，在成年水貂體內病毒呈持續(xù)性感染導致漿細胞彌漫性增生，產生的高水平病毒抗體與抗原結合形成免疫復合物沉積于腎臟，導致腎小球腎炎[1-3]，在我國感染率高，對水貂養(yǎng)殖業(yè)造成很大危害[4]。中國長期養(yǎng)殖水貂，阿留申病毒感染嚴重，CIEP檢測陽性率達40%～80%[5,6]，高感染率貂場達100%。水貂阿留申病目前無有效疫苗，主要通過聯合檢疫來淘汰、凈化阿留申病貂群。常用的檢測方法有碘凝集反應（IAT）、對流免疫電泳（CIEP）以及聚合酶鏈式反應（PCR）。IAT最早被用于阿留申病的診斷，通過檢測阿留申病貂血清中高濃度-球蛋白間接診斷阿留申病，由于導致高-球蛋白血癥不是阿留申病特有的特征，所以IAT檢測不具有特異性[7,8]。CIEP通過檢測水貂血清中病毒抗體來診斷阿留申病，特異性強，被廣泛用于阿留申病的診斷與凈化[9]，但針對感染初期未產生抗體的水貂容易造成漏檢，還容易忽略動物的免疫力造成很大一部分抗體陽性的非患病貂（CIEP+IAT PCR）被淘汰。PCR檢測技術靈敏度高，可直接檢測水貂體內阿留申病毒，常被用于AMDV的核酸檢測[10-12]。

利用單一檢疫的方法不能全面判斷水貂ADV的感染狀態(tài)，經聯合檢疫發(fā)現貂場中存在5種感染狀態(tài)的貂群，分別為CIEP IAT PCR、CIEP IAT PCR+、CIEP+IAT+PCR+、CIEP+IAT PCR+和CIEP+IAT PCR貂群。與CIEP IAT PCR無感染貂比較，阿留申病貂血液中形成阿留申病毒及其抗體免疫復合物，檢測呈現CIEP+IAT+PCR+感染狀態(tài)，產仔成活數明顯下降[3,13]?？贵w呈陽性的CIEP+貂群中存在感染AMDV而無癥狀貂[14,15]，水貂血清-球蛋白正常，產仔成活數不受影響。養(yǎng)殖生產中發(fā)現CIEP+IAT PCR和CIEP+IAT PCR+貂群對貂場留種具有很大價值，其中CIEP+IAT PCR貂群曾感染AMDV，抗體呈陽性，但血清中-球蛋白含量正常，且外周血中檢測不到病毒，產仔性能好，這部分貂群中存在一定比例的AMDV抗性貂[16-19]；CIEP+IAT PCR+貂群感染AMDV，抗體呈陽性，血清中-球蛋白含量正常，病毒僅低水平存在于淋巴組織，對繁殖性能影響較低，表現對AMDV耐受性[15,20]，留種這部分水貂對提高貂群整體的免疫力和對抗AMDV有很大幫助。若采用單一的抗體檢測留種CIEP貂群，而剔除CIEP+的抗性貂和耐受貂，強化了貂群對AMDV的易感性，環(huán)境中殘留的病毒或者外來病毒的入侵容易造成CIEP貂群暴發(fā)感染[18]。本研究利用多年來對遼寧、吉林不同貂場聯合檢疫數據，統(tǒng)計分析不同品種的貂感染狀態(tài)的動態(tài)分布，不同貂種AMDV抗性貂（CIEP+IAT PCR）比例和變化規(guī)律，旨在研究不同貂種對水貂阿留申病的抗性差異，為實際生產中貂場留種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預處理

從2017年12月至2020年12月，分別對吉林、遼寧省多個高感染率貂場不同品種水貂于11～12月份進行檢疫。大連A場已連續(xù)開展多年的聯合檢疫淘汰的防控措施，2018年采集5 633只3個品種的水貂血液，其中金州黑貂3 941只，銀藍貂1 179只，咖啡貂513只；2019年采集2 388只，其中金州黑貂1 585只，銀藍貂219只，咖啡貂584只。吉林B場本地貂采集262只，其中長毛褐貂119只，金州黑貂122只，銀藍貂21只。2020年沈陽C場為丹麥引種貂在國內已養(yǎng)殖3年，采集454只，其中銀藍貂117只，白貂165只，咖啡貂172只。2018年沈陽D貂場為在國內已養(yǎng)殖5年的引種貂，采集1 642只白貂血液。各貂場水貂為大于2年齡的經產貂和7月齡的當年貂。

采血操作：對水貂個體逐一編號，使用含促凝劑的采血管，采用剪趾法進行血液采集，將采集的新鮮血液放4℃冰箱過夜自然沉降析出血清或于500 g（Eppendorf 5804/5804R，德國）離心10 min收集上層血清，將血清放于﹣20℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑和儀器

血液DNA直接PCR試劑盒購自遼寧生物醫(yī)藥有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、DL1000 DNA Marker購自寶生物（大連）有限公司；分析純KI2和I2購自Sigma公司；瓊脂糖購自全式金（北京）生物技術有限公司。AMDV-G株CIEP抗原、AMDV標準陽性和陰性血清由本實驗室保存，AMDV-G株CIEP抗原、AMDV標準抗原和陰、陽性血清由中國農業(yè)科學院特產研究所提供。

1.3 引物設計及合成

根據NCBI上公布的阿留申病毒的序列信息，在保守區(qū)域篩選引物，并通過Oligo 7.0進行引物驗證。上游引物AV3F為：5′-caccaacaagtaatgacaccttggt-3′，下游引物AV3R為：5′-ggttggtttggttgctctccaagga-3′，擴增子長度約為350 bp，引物由寶生物公司合成。

1.4 水貂阿留申病的IAT、CIEP檢測

水貂血清樣品進行IAT檢測，按照參考文獻[11]配置碘試劑。取10L水貂血清與等量配置的碘試劑混勻，5 min內出現沉淀則判定為IAT陽性。

水貂血清樣品進行CIEP檢測，試驗參照《水貂阿留申病對流免疫電泳操作規(guī)程SN/T 1314-2003》進行。使用本實驗室保存的AMDV標準抗原和陰、陽性血清作為陰、陽性對照，按規(guī)程判定結果。若第1次檢測陰性，第2次檢測為陽性，則補測1次，再次檢測出現沉淀線則判定CIEP陽性，反之判定為陰性。

1.5 水貂血清中AMDV的PCR檢測

隨機選取不同貂場檢出的CIEP+IAT和CIEP+IAT+樣品，利用血液DNA直接PCR試劑盒，對血清樣品進行檢測，將本實驗室保存的AMDV陽性和陰性血清樣本分別作為陽性和陰性對照。PCR總反應體系為40L，3.6L核酸釋放劑加入到2.0L血清樣本中裂解10 min。PCR反應液由32L PCR reaction buffer，上下游引物各20 pmol，1L Taq酶，加無核酸的水至總反應體系為40L。PCR反應條件為：95℃5 min預變性，94℃40 s變性，55℃35 s退火，72℃30 s延伸，反應35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%的瓊脂糖電泳驗證。

1.6 數據處理

依據3種聯合檢疫方法對4個貂場不同貂種存在的不同感染狀態(tài)分類，并計算CIEP+IAT貂群、CIEP+IAT PCR貂群在不同品種水貂群中所占比例。利用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件分析每個貂場不同品種水貂群主要感染狀態(tài)的差異，利用卡方檢驗進行差異性分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義，差異顯著。

2 結果

2.1 不同貂種CIEP+IAT貂群的差異分析

經檢疫發(fā)現，4個高感染率貂場的CIEP檢疫陽性貂群中不同品種水貂IAT檢疫陰性率存在差異，4個貂場不同品種的經產貂和當年貂AD的CIEP、IAT檢疫結果見表1和表2。

A場2018年檢疫結果顯示，經產貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂58.4%＞銀藍貂46.1%＞咖啡貂38.6%（P＜0.01）；當年貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂37%＞銀藍貂20.8%（P＜0.01）。A場經2018年檢疫篩選保留CIEP+IAT貂，2019年檢疫結果顯示，經產貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂87.8%＞銀藍貂54.7%＞咖啡貂45.2%（P＜0.01）；當年貂CIEP+IAT群體占比排序，金州黑貂64.7%＞銀藍貂53.1%＞咖啡貂44.6%（P＜0.01）。經CIEP+IAT貂選種后，2019年貂群平均窩產仔成活數3.7只/窩，較2018年貂群平均產仔成活數3.2只/窩有所提高。

B場檢疫結果顯示，經產貂CIEP+IAT群體占比排序，長毛褐貂92.3%＞銀藍貂87.5%＞金州黑貂54.3%（P＜0.01）；當年貂CIEP+IAT群體占比排序，長毛褐貂80%＞銀藍貂53.8%＞金州黑貂50%（P＜0.01）。貂群平均產仔成活數，長毛貂約4.5只/窩，銀藍貂約4.0只/窩，金州黑貂約3.5只/窩。

C場檢疫結果顯示，經產貂CIEP+IAT群體占比排序，銀藍貂54.7%＞白貂42.5%＞咖啡貂37.2%（P＜0.05）；全場貂群平均產仔數約在2～3只/窩。

D場檢疫結果顯示，經產白貂CIEP+IAT占比46.7%，經CIEP+IAT選種后，白貂群平均產仔成活數提高約1只/窩。

綜合這4個貂場的檢疫結果表明，長毛褐貂和金州黑貂的IAT檢疫陰性率較高，其次為銀藍貂、白貂和咖啡貂，經產貂和當年貂均呈現這種趨勢。其中A場金州黑貂、B場均為本地化貂、D場白貂為本地化貂，其他水貂均為引種貂，結果表明本地化貂群中CIEP+IAT群體占比明顯高于引種貂群（圖1），且D場經本地化飼養(yǎng)選種后CIEP+IAT貂群的比例較C場白貂高出7.7%（表1），并且各貂場不同品種經產貂CIEP+IAT群體占比普遍高于當年貂（表1、表2）?？ǚ綑z驗結果表明，在高感染率貂場，不同品種水貂中CIEP+IAT群體占比存在明顯差異，且經過本地化飼養(yǎng)后的長毛褐貂、金州黑貂群體中CIEP+IAT貂比例較高。

表1 經產貂CIEP和IAT聯合檢測結果Table 1 The combined detection result by CIEP and IAT in multiparous mink groups

表2 當年貂CIEP和IAT聯合檢測結果Table 2 The combined detection result by CIEP and IAT in yearling mink groups

圖1 不同貂種CIEP+IAT分布Fig.1 CIEP+IAT distribution of different mink species

2.2 CIEP+IAT-和CIEP+IAT+貂群的PCR檢測分析

隨機選取不同貂場部分CIEP+IAT血清樣品進行PCR檢測。綜合2.1及本結果分析顯示，A場經CIEP+IAT選擇留種后，CIEP+IAT貂群的PCR比例提高；不同貂場CIEP+IAT貂群中PCR比例較高，主要在59.6%～93.8%（表3）；而隨機抽取的CIEP+IAT+貂群PCR+比例普遍偏高，主要在52.5%～100%（表4、圖2），證實了CIEP+IAT貂群中PCR比例高，指示CIEP+IAT貂群的病毒檢出率低。例外的，經CIEP+IAT留種選擇后檢測到的CIEP+IAT+貂的PCR+比例降低，如A場銀藍貂、金州黑貂CIEP+IAT+PCR+比例（表4），顯示貂群整體的病毒載量下降。檢疫結果表明，不同高感染率貂場的不同品種水貂CIEP+IAT PCR貂群的比例存在明顯差異，本地化貂種CIEP+IAT PCR占比較高，其中B場金州黑貂93.8%、長毛褐貂占71.4%，D場白貂占71.9%（圖2）。C場檢疫結果顯示，不同貂種CIEP+IAT PCR占比排序為，銀藍貂80%＞白貂70.1%＞咖啡貂59.6%（P＜0.05）。結合多年生產實踐記錄發(fā)現，本地化長毛褐貂產仔成活平均數約4.5只/窩，本地化金州黑貂約4只/窩；而丹麥引種貂在國外產仔成活數平均在5～6只/窩，引入國內養(yǎng)殖2～3年后由于阿留申病毒的感染增加，白貂產仔存活數在2～3只/窩、咖啡貂約2只/窩，在高感染場新引種母貂平均產仔成活數下降明顯。由此可見，經本地化飼養(yǎng)的貂群生產性能普遍高于新引種貂群且貂群中抗性貂比例較高。綜合幾個貂場檢疫結果及生產實踐表明，不同貂種中CIEP+IAT PCR貂群比例差異明顯，且比例越高，表現為該貂種對水貂阿留申病的抗性越強，長毛褐貂和金州黑貂為本地化貂，貂場每年選取健康狀況良好、產仔＞4只/窩的母貂進行留種，經過連續(xù)多年的篩選留種貂抗性明顯高于引種貂，并且產仔存活數高。

圖2 CIEP+IAT和CIEP+IAT+貂群中PCR檢測分布Fig.2 The distribution of PCR detection to CIEP+IAT and CIEP+IAT+mink groups

表3 CIEP+IAT―貂群PCR檢測結果Table 3 The results of PCR detection to CIEP+IAT―mink group

表4 CIEP+IAT+貂群PCR檢測結果Table 4 The results of PCR detection to CIEP+IAT+mink group

3 討論

3.1 本研究通過對遼寧、吉林不同高感染率貂場的CIEP、IAT和PCR聯合檢疫數據分析，在高感染率貂場，聯合檢疫發(fā)現CIEP+IAT貂群中PCR比例高指示病毒檢出率低，通過CIEP+IAT選種留種，各貂種中CIEP+IAT和CIEP+IAT PCR貂的比例提高顯著[17]，且CIEP+IAT無癥狀貂的平均窩產仔成活數接近未感染貂。山東某貂場經5年CIEP+IAT貂選種留種，其比例從25%提高到75%，CIEP+IAT貂群比例提高顯著，貂群平均產仔成活數從2～3只/窩提高到4～5只/窩，且CIEP+IAT無癥狀貂的平均窩產仔成活數接近未感染貂。因此血樣聯合檢疫呈現CIEP+IAT PCR狀態(tài)可作為抗病性貂的篩選指標；通過聯合檢疫技術選擇阿留申抗病貂適合高感染貂場選種應用。本地化貂群中AMDV抗性貂（CIEP+IAT PCR）比例為58.4%～92.3%。長毛褐貂和金州黑貂為本地化水貂，經過逐代選種，其CIEP+IAT PCR抗病貂比例高，貂群平均產仔成活數也提高。而國外引種貂采用抗體陽性淘汰凈化選種，大量CIEP+的抗性貂和耐受貂被淘汰，導致群體對AMDV的易感性增強[18]；在高感染率貂場環(huán)境被病毒污染，引種貂群自然感染條件下符合抗病指標的水貂比例低，且產仔成活數低。在國內生產實踐發(fā)現耐受貂和抗性貂在生產性能、產仔存活數方面略低于無感染貂，對貂場具有留種意義。

3.2 A場有本地化的金州黑貂、國外引種的銀藍貂和咖啡貂，本地貂阿留申病抗病性優(yōu)于引種貂，貂種間阿留申病抗性差異極顯著（P＜0.01）。A場經過抗病貂CIEP+IAT初選留種，與2018比較，2019年金州黑貂CIEP+IAT PCR比例提高了8.7%，銀藍貂提高了31.7%，咖啡貂提高46.9%，表明抗病性篩選效果顯著。B場均為本地化貂，顯示抗病性金州黑貂＞長毛褐貂＞銀藍貂，貂種間阿留申病抗性差異極顯著（P＜0.01）。C場引種貂抗病性比較，銀藍貂＞白貂＞咖啡貂，貂種間阿留申病抗性差異極顯著（P＜0.01）。與C場比較，D場經本地化飼養(yǎng)選種的白貂CIEP+IAT PCR比例高出1.8%，抗病性增強。聯合檢疫還發(fā)現，在同種環(huán)境下每個貂場不同品種的經產貂抗病性均高于當年貂，CIEP+IAT高出比例為0.6%～33.7%。在檢疫中還發(fā)現，經CIEP+IAT選擇留種后檢測到的CIEP+IAT+貂的PCR+比例降低，見表4中A場銀藍貂、金州黑貂CIEP+IAT+PCR+比例，顯示貂群整體的病毒載量下降。在東北主養(yǎng)殖區(qū)高感染環(huán)境下，本地化貂抗病性強是經歷長期抗病表型篩選的積累結果，采用聯合檢疫選擇抗病貂對提高貂群阿留申病抗病性效果明顯。水貂感染AMDV后感染發(fā)展類型受多種因素的影響，主要與病毒的致病力、水貂自身的免疫力以及環(huán)境因素等相關。不同品種貂的抗病性差異除受選種方法影響外，各品種抗病性主要由控制抗病性的基因決定，具體抗病基因差異是深入研究的方向。

4 結論

綜上所述，針對高感染率的貂場，由于CIEP檢疫陽性率高，所以僅利用CIEP檢疫淘汰阿留申病貂并不適合，容易淘汰大量的CIEP+無阿留申病貂，建議高感染貂場采用聯合檢疫的方法選擇CIEP+IAT PCR貂，并結合其生產性能留種。本地化的長毛褐貂、金州黑貂和白貂中CIEP+IAT PCR貂群對阿留申病的抗性較強，建議貂場多篩選AMDV抗性貂進行留種。對引種的銀藍、咖啡和白貂，加強CIEP+IAT PCR抗病貂選種，以此來提高貂群的整體健康狀況和生產性能。