葉婷丹, 雷學(xué)忠
1 四川大學(xué) 華西臨床醫(yī)學(xué)院, 成都 610041; 2 四川大學(xué)華西醫(yī)院 感染性疾病中心, 成都 610041
肝癌是全球第四大常見(jiàn)惡性腫瘤。最常用的肝癌標(biāo)志物主要是AFP、異常凝血酶原 (protein induced by vitamin K absence,PIVKA-Ⅱ)等[1]。目前臨床上最常用的肝癌篩查模式——AFP聯(lián)合超聲檢測(cè)對(duì)肝硬化中晚期患者漏診誤診率高、對(duì)小腫瘤的檢出率低,以致大部分肝癌患者在被確診時(shí)已處于中晚期,導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及不良預(yù)后。美國(guó)肝病學(xué)會(huì)指南早已不再建議將AFP檢測(cè)作為單獨(dú)篩查診斷肝癌的指標(biāo)。
近年來(lái),隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科向癌癥領(lǐng)域延伸,液體活檢應(yīng)運(yùn)而生,已成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。液體活檢是指從血液中捕獲游離的腫瘤信息,進(jìn)而反映機(jī)體全身腫瘤信息。與傳統(tǒng)的穿刺活檢相比,液體活檢具備無(wú)創(chuàng)、可反復(fù)采樣、可實(shí)時(shí)“更新反饋”腫瘤負(fù)荷、克服腫瘤異質(zhì)性、指導(dǎo)個(gè)性化用藥等優(yōu)點(diǎn)[2]。尤其是循環(huán)游離DNA(circulating free DNA, cfDNA),在腫瘤的早期篩查、診斷、監(jiān)測(cè)、輔助指導(dǎo)治療,腫瘤來(lái)源定位,腫瘤預(yù)后及復(fù)發(fā),甚至在器官移植、孕婦非侵入性產(chǎn)前檢測(cè)等研究方向都有了更加深入的研究進(jìn)展[3-4]。cfDNA自1948年被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),已有不少學(xué)者[5-13]對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)歸納、回顧。本文主要對(duì)近年來(lái)液體活檢法聯(lián)合各類(lèi)標(biāo)志物診斷早期肝癌的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展及其在臨床應(yīng)用中的潛力進(jìn)行綜述。
液體活檢具體內(nèi)容包括cfDNA檢測(cè),循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)檢測(cè)及外泌體檢測(cè)。其中,CTC是指存在于血液中的游離腫瘤細(xì)胞,在腫瘤的術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等預(yù)后評(píng)價(jià)方面具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。外泌體則通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展,其與肝癌的早期診斷、耐藥性檢測(cè)、預(yù)后評(píng)估及治療密切相關(guān)。然而,大多數(shù)外泌體的研究尚處于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體外取材的早期研究階段,需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。而cfDNA作為液體活檢重點(diǎn)研究對(duì)象,1948年被Mandel等[14]首次報(bào)道后未引起重視,直到1977年Leon等[15]研究發(fā)現(xiàn)cfDNA在腫瘤患者血液中濃度明顯增加。經(jīng)過(guò)研究者們數(shù)十年的不斷驗(yàn)證和深入探索,cfDNA在癌癥的診斷、監(jiān)測(cè)、治療等各個(gè)方面的應(yīng)用逐漸廣泛。
目前cfDNA的來(lái)源機(jī)制尚不完全明確,大多數(shù)研究認(rèn)為其是由腫瘤細(xì)胞、體細(xì)胞凋亡或壞死后釋放入血,cfDNA片段也被證實(shí)含有與同源腫瘤組織相同的基因異常改變?nèi)琰c(diǎn)突變、擴(kuò)增、重排等[16]。cfDNA在健康人外周血濃度平均值約30 ng/mL,而在腫瘤患者中濃度明顯升高,血漿中的cfDNA半衰期為1.5~2 h[17]。根據(jù)具體檢測(cè)內(nèi)容不同,cfDNA液體活檢主要包括最初的濃度檢測(cè)即定量分析,進(jìn)一步的定性分析如cfDNA完整性評(píng)估、cfDNA甲基化、腫瘤特異性DNA、cfDNA點(diǎn)突變、雜合子缺失及微衛(wèi)星不穩(wěn)定、新興的cfDNA片段化模式以及尚處于假設(shè)階段、未來(lái)可能涉及到的其他研究方向如血漿中線粒體DNA的分?jǐn)?shù)濃度等。
cfDNA的應(yīng)用目前面臨許多障礙。除了患者血漿中腫瘤來(lái)源特異性DNA比例通常很低這一因素需要一定的技術(shù)支持外,還有不少亟待解決的問(wèn)題。首先,臨床實(shí)踐中可獲得的血液量是有限的,可用標(biāo)本的cfDNA通常處于低水平;其次,cfDNA在采血后應(yīng)盡快處理,以免受到血細(xì)胞裂解釋放的背景DNA干擾。不同的DNA分離技術(shù)和儀器也可能產(chǎn)生cfDNA的顯著變化。例如目前觀察到的常用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化等離子體方法可以導(dǎo)致輸入DNA的降解以及測(cè)序數(shù)據(jù)偏差;而DNA甲基化譜在性別和種族方面也表現(xiàn)出個(gè)體差異及腫瘤異質(zhì)性,可能影響甲基化對(duì)應(yīng)的檢測(cè)效果。目前該研究領(lǐng)域仍缺乏全球標(biāo)準(zhǔn)化cfDNA分離方案及檢測(cè)流程。
Liao等[18]第一次對(duì)2015年前已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析以評(píng)估cfDNA在肝癌診斷中的應(yīng)用,結(jié)果表明,cfDNA在早期肝癌診斷中具有一定的潛力,但是單純cfDNA濃度診斷亞組及單基因甲基化亞組的診斷效能均表現(xiàn)不穩(wěn)定,不足以反映腫瘤的真實(shí)情況。同時(shí),AFP聯(lián)合cfDNA診斷亞組(共6例)中檢測(cè)敏感度、特異度等所有結(jié)果均有改善。由此提出單獨(dú)運(yùn)用cfDNA的定量和定性分析進(jìn)行肝癌診斷時(shí),其結(jié)果有很高的假陽(yáng)性或假陰性概率,這將限制cfDNA的實(shí)際價(jià)值。
現(xiàn)有更多研究表示cfDNA適宜多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)或與其他肝癌診斷標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè),筆者回顧2021年7月前已發(fā)表的聯(lián)合診斷型研究詳見(jiàn)附錄,包括cfDNA定量及定性分析指標(biāo)間的相互聯(lián)合診斷;不同甲基化基因的組合診斷;聯(lián)合AFP、PIVKA-Ⅱ、血清甲胎蛋白異質(zhì)體(serum alpha-fetoprotein variants,AFP-L3)、α-L-巖藻糖苷酶(α-L fucosidase,AFU)診斷;甲基化及腫瘤拷貝數(shù)差之間的聯(lián)合[19-42]。其中,cfDNA定量或定性分析(尤其是DNA甲基化、腫瘤特異性突變等)與AFP、PIVKA-Ⅱ的聯(lián)合檢測(cè)備受關(guān)注。
多項(xiàng)基礎(chǔ)研究[43-44]證實(shí),血液中檢測(cè)出的DNA啟動(dòng)子甲基化與其在腫瘤組織中高度一致,DNA甲基化在聯(lián)合AFP等蛋白標(biāo)志物時(shí)可提高診斷效能,最早的聯(lián)合甲基化液體活檢可追溯至2011年。2017年,Cohen等[45]研究證實(shí),將基因突變與胰腺癌相關(guān)的生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可以提高經(jīng)血液診斷早期胰腺癌的敏感性,且不會(huì)顯著提高假陽(yáng)性率。其在研究中也闡述了聯(lián)合型液體活檢的兩大顯著優(yōu)點(diǎn):既解決了cfDNA缺乏實(shí)體腫瘤定位性的問(wèn)題,其檢測(cè)效能又優(yōu)于任一單一腫瘤標(biāo)志物。這種方法被證實(shí)有很好前景應(yīng)用于多種實(shí)體癌癥的早期篩查診斷中[43]。在肝癌領(lǐng)域,蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物與超敏腫瘤特異性DNA結(jié)合的一系列研究成為熱門(mén),并不斷有研究證實(shí)cfDNA在肝癌診斷方面可與AFP或PIVKA形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。液體活檢檢測(cè)原理及內(nèi)容完全不同于蛋白標(biāo)志物,在AFP陰性人群中表現(xiàn)依舊良好。但此類(lèi)研究往往自肝癌患者血液及腫瘤組織學(xué)活檢對(duì)比中得出,驗(yàn)證隊(duì)列同樣為已確診的腫瘤患者,大多為橫斷面或回顧性研究,缺乏進(jìn)一步大規(guī)模臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。Qu等[24]構(gòu)建的肝癌聯(lián)合液體活檢診斷模型中不但納入了年齡、性別等可分析的臨床特征,其驗(yàn)證隊(duì)列為前瞻性研究,并隨訪至今。該診斷模型加入DNA甲基化調(diào)整后,正在筆者中心進(jìn)行一項(xiàng)乙型肝炎肝硬化患者早期肝癌篩查的前瞻性診斷實(shí)驗(yàn)研究,預(yù)計(jì)納入500例。
現(xiàn)今臨床研究中可嘗試用于肝癌診斷的生物標(biāo)志物越來(lái)越多,包括傳統(tǒng)經(jīng)典蛋白標(biāo)志物、表觀遺傳標(biāo)志物(cfDNA、肝癌相關(guān)基因、微小RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA等)、新興糖代謝組學(xué)寡糖鏈組分檢測(cè)(G-test)等。目前已有研究涉及到三聯(lián)甚至更多蛋白標(biāo)志物的聯(lián)合診斷,例如甲基化基因聯(lián)合檢測(cè)面板、異常甲基化基因與微小RNA組合模型[37]、G-test聯(lián)合AFP及PIVKA-Ⅱ[46]等等,但識(shí)別準(zhǔn)確可行的標(biāo)志物及診斷模式仍十分具有挑戰(zhàn)性,研究目標(biāo)應(yīng)該依舊是不顯著降低特異性的前提下盡可能提高檢測(cè)手段的敏感性。
cfDNA的優(yōu)勢(shì)在于相對(duì)無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)、可監(jiān)測(cè),與腫瘤突變具有高度一致性;且檢測(cè)原理完全不同于蛋白標(biāo)志物,經(jīng)研究證實(shí)與AFP、PIVKA等無(wú)顯著相關(guān)性,在肝癌診斷中具有疊加效應(yīng);對(duì)于評(píng)估預(yù)后、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)方面亦有重要作用。不足之處在于cfDNA檢測(cè)敏感度仍然較低,單獨(dú)應(yīng)用穩(wěn)定性差,不推薦獨(dú)立應(yīng)用;其檢測(cè)大體基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和下一代測(cè)序技術(shù)(NGS)兩大類(lèi),尤其是NGS檢測(cè)依賴(lài)于高通量的技術(shù)、高質(zhì)量的血液樣本、高額的研究成本,cfDNA的樣品處理、DNA提取、定量和數(shù)據(jù)分析等方面未得到規(guī)范統(tǒng)一,使得這些研究結(jié)果難以直接比較;此外,已發(fā)表的研究樣本量普遍偏少,部分研究缺乏與AFP等常用標(biāo)志物的對(duì)比分析,部分研究在選擇肝癌患者時(shí)僅關(guān)注HBV或HCV相關(guān)肝癌,其結(jié)果缺乏包容性及可重復(fù)性。目前研究顯示,cfDNA在聯(lián)合應(yīng)用中診斷敏感度可提高至70%~80%,特異度80%~90%。cfDNA對(duì)肝癌的診斷和/或預(yù)后價(jià)值的明確結(jié)論尚需進(jìn)一步的多中心、大樣本、前瞻性研究。為最大程度發(fā)揮cfDNA價(jià)值,在今后相關(guān)研究設(shè)計(jì)過(guò)程中可考慮建立規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、可重復(fù)的cfDNA檢測(cè)流程及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn);選擇已被證實(shí)的特異性肝癌突變基因、甲基化位點(diǎn)進(jìn)行互補(bǔ)驗(yàn)證、聯(lián)合診斷甚至序貫診斷;納入各種病因、各臨床分期肝癌患者分層分析,適當(dāng)擴(kuò)大樣本量,增加前瞻性研究比例;繼續(xù)探索驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的潛在標(biāo)志物如外泌體、游離RNA等。隨著以上問(wèn)題的逐一解決,cfDNA聯(lián)合型液體活檢法必然能夠打開(kāi)“無(wú)創(chuàng)”診斷肝癌的快捷之門(mén),使得肝癌診斷水平得到質(zhì)的飛躍。
利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻(xiàn)聲明:葉婷丹對(duì)研究的思路或設(shè)計(jì)有關(guān)鍵貢獻(xiàn),參與了研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過(guò)程,參與起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容;雷學(xué)忠負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。
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