陳澤昊， 朱文杰， 申兵兵， 江建新

武漢大學人民醫(yī)院 肝膽外科， 武漢 430061

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)來源于膽管上皮細胞，是第二常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤[1]，近年來ICC的發(fā)病率和死亡率不斷上升，尤其是在亞洲國家[2]。全球范圍內(nèi)ICC常見的危險因素包括慢性乙型或丙型肝炎、飲酒、炎癥性腸病以及膽汁淤積[3]。盡管外科手術(shù)、放化療等治療方法已得到較好的發(fā)展，但由于ICC的起病隱匿及化療耐藥性，患者的長期生存率仍不十分理想[1]，因此尋找新型有效的藥物對ICC的治療具有重要的意義。

6-姜酮酚(6-Paradol)是一種從生姜中分離出來的具有生物活性的酚類化合物，它具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血糖血脂和神經(jīng)保護等多種生物活性[4]。Surh等[5]發(fā)現(xiàn)6-Paradol具有抗腫瘤、抑制腫瘤啟動子刺激產(chǎn)生的炎癥、抑制TNFα的產(chǎn)生和表皮鳥氨酸脫羧酶激活的作用。另一項研究[6]表明，6-Paradol對DMBA誘導的倉鼠頰囊腫瘤的形成有明顯的抑制作用。然而，6-Paradol對ICC的作用目前尚未闡明，有待進一步深入探討。

STAT3是轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導子與激活子家族的成員之一，可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、遷移侵襲、血管生成、炎癥和免疫反應(yīng)，它激活后轉(zhuǎn)位入核內(nèi)并與靶基因DNA相結(jié)合，調(diào)控靶基因Bcl-2及p21等的轉(zhuǎn)錄[7]；自1993年發(fā)現(xiàn)p21是細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的強效抑制劑以來[8]，它就被認為是一種重要的調(diào)節(jié)劑。p21涉及多種細胞功能，包括調(diào)控G1/S細胞周期進程、DNA損傷、細胞凋亡及細胞遷移侵襲。因此，藥物通過靶向STAT3-p21通路可能是有效的治療方式。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人ICC細胞系HCCC 9810和HUCCT1(美國ATCC公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，6-Paradol(MCE公司)，CCK-8試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Transwell小室(武漢博士德生物有限公司),Lipofectamine2000Reagent/Lipofectamine3000Reagent、Optim-MEM(Invitrogen公司),mRNA上下游引物(生工生物公司),兔抗人STAT3、p-STAT3、p21、SRC、p-mTOR、GAPDH單克隆抗體(武漢三鷹公司)，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(南京諾維贊生物科技公司),蛋白成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 CCK-8法檢測6-Paradol作用后的細胞增殖活性 將細胞接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，分別用濃度為20、40、60、80、100 μmol/L的6-Paradol處理細胞，對照組予以含有DMSO(體積分數(shù)0.25%)的RPMI 1640培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱中48 h、72 h后測吸光度。相對增殖率(%)=(1-藥物組OD450 nm值/對照組OD450 nm值)×100%。

1.3 克隆形成實驗檢測6-Paradol作用后的細胞克隆形成能力 將細胞接種于6孔板中待細胞貼壁后以等體積DMSO(對照組)、不同濃度的6-Paradol(10、20和40 μmol/L)處理細胞。14 d后計數(shù)各組的克隆形成數(shù)。

1.4 劃痕愈合實驗檢測6-Paradol作用后的細胞遷移能力 將細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達90%時進行劃痕并拍照觀察0 h劃痕情況是否一致，然后加入等體積DMSO(對照組)、不同濃度6-Paradol(10、20和40 μmol/L)。24 h后測量劃痕面積并計算相對遷移率。相對遷移率(%)=各組24 h劃痕面積/對照組24 h劃痕面積×100%。

1.5 Transwell小室法檢測6-Paradol作用后的細胞遷移侵襲能力 將細胞接種于Transwell上室中，待細胞貼壁后分別加入等體積DMSO(體積分數(shù)為0.25%，作為對照組)和不同濃度6-Paradol(10、20和40 μmol/L)。培養(yǎng)48 h后固定染色，隨機選取5個視野(100倍)拍照，image J計數(shù)侵襲細胞數(shù)。

1.6 生物信息學軟件預(yù)測6-Paradol作用蛋白靶點 在線數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction(http://www.swiss targetprediction.ch/)是一個預(yù)測化合物作用蛋白靶點的網(wǎng)站，可以通過導入化合物的結(jié)構(gòu)文件預(yù)測化合物作用的蛋白靶點。本研究從化合物數(shù)據(jù)庫PubChem Compound Search database(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)中下載6-Paradol的二維結(jié)構(gòu)文件，把文件導入到Swiss Target Prediction中后獲得6-Paradol作用的蛋白靶點。應(yīng)用在線公共數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape軟件進行可視化及分析。

1.7 Western blot檢測細胞中STAT3、p-STAT3、p21、Bcl-2、SRC、p-MTOR的表達 以不同濃度的6-Paradol(0、10、20和40 μmol/L)處理細胞48 h后提取蛋白，定量后加入到分離膠中電泳2 h以分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；常溫下封閉2 h后分別加入兔抗人SRC、STAT3、p-STAT3、p21、Bcl-2、p-MTOR和GAPDH單克隆抗體，4 ℃過夜。TBST洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h。曝光并檢測各蛋白條帶的灰度值。

1.8 藥物親和反應(yīng)的靶點穩(wěn)定性(DARTS)檢測6-Paradol與蛋白靶點的相互作用 細胞提取蛋白，加入M-PER緩沖液稀釋至蛋白濃度為1.5 mg/mL，然后分別加入等體積的DMSO及40 μmol/L 6-Paradol，冰上孵育1 h。孵育結(jié)束后向各組混合液中加入鏈霉菌蛋白酶PBS溶液(鏈霉菌蛋白酶濃度為5 mg/mL，酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50)，40 ℃下酶解15 min。酶解結(jié)束后立即加入50 μL蛋白上樣緩沖液終止酶解反應(yīng)。

1.9 qRT-PCR 轉(zhuǎn)染細胞48 h后提取總RNA并測定濃度后逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用qRT-PCR測量相關(guān)基因的表達，使用2-ΔΔCt法計算相關(guān)基因的表達量。實驗中涉及的主要引物序列如下。STAT3:F-5′-CGGCGGAAACTCTACTTGTCCTT-3′, R-5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；p21: F-5′- TGTCCGTCAGAACCCATGC-3′，R-5′- AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3′；GAPDH: F-5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′, R-5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。

2 結(jié)果

2.1 6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，DMSO(對照組)和20、40、60、80、100 μmol/L 6-Paradol作用48 h及72 h后膽管癌細胞的增殖率依次下降(P值均<0.001)(圖1 a、b)；應(yīng)用GraphPad軟件計算得出48 h時6-Paradol對HCCC 9810細胞的IC50值為85.69 μmol/L；72 h時的IC50值為65.39 μmol/L; 48 h時6-Paradol對HUCCT1細胞的IC50值為122.30 μmol/L；72 h時的IC50值為84.33 μmol/L?？寺⌒纬蓪嶒灆z測結(jié)果(圖1c)顯示，DMSO(對照組)和10、20、40 μmol/L 6-Paradol組中細胞克隆形成數(shù)依次遞減(P值均<0.05)。以上結(jié)果提示,6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞的增殖具有抑制作用并呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。

2.2 6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞遷移侵襲的影響 劃痕愈合實驗結(jié)果(圖2a、c)顯示，DMSO(對照組)和10、20、40 μmol/L 6-Paradol處理24 h后HCCC 9810細胞(t值分別為4.31、5.02、3.03，P值均<0.05)及HUCCT1細胞(t值分別為3.86、3.59、4.96，P值均<0.05)的相對遷移率依次遞減。Transwell實驗在檢測遷移能力時結(jié)果顯示(圖2b)，DMSO和10、20、40 μmol/L 6-Paradol處理組每個視野下遷移過膜的HCCC 9810(t值分別為4.10、2.88、6.30，P值均<0.05)和HUCCT1(t值分別為2.99、5.85、6.58，P值均<0.05)細胞數(shù)依次遞減；Transwell實驗在檢測侵襲能力時結(jié)果顯示(圖2d)，DMSO和10、20、40 μmol/L 6-Paradol處理組每個視野下侵襲過膜的HCCC 9810(t值分別為13.35、3.68、2.85，P值均<0.05)和HUCCT1(t值分別為4.30、11.21、25.09，P值均<0.05)細胞數(shù)依次遞減。這些結(jié)果表明6-Paradol可顯著抑制膽管癌細胞的遷移侵襲能力并呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.3 6-Paradol作用的蛋白靶點預(yù)測及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從PubChem Compound Search database中獲得6-Paradol的二維結(jié)構(gòu)(圖3a),使用Swiss Target Prediction預(yù)測了6-Paradol作用的蛋白靶點，在線公共數(shù)據(jù)庫STRING構(gòu)建蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)并用Cytoscape軟件進行可視化，結(jié)果顯示Degree得分最高的5個蛋白靶點為SRC、STAT3、HSP90AA1、ESR1、mTOR(圖3b)。

2.4 6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞中STAT3、p-STAT3、SRC、p-mTOR、Bcl-2、p21和p53蛋白表達的影響 基于已有的文獻研究，選擇了STAT3、SRC和mTOR作為6-Paradol可能的作用靶點進行下一步研究。 DMSO(對照組)和10、20、40μmol/L6-Paradol處理48 h后HCCC 9810細胞(t值分別為3.27、3.06、4.68，P值均<0.05)及HUCCT1細胞(t值分別為2.99、3.52、6.44，P值均<0.05)中STAT3的相對表達量均隨著藥物濃度的增加逐漸減少(圖4a、b)；同樣地，DMSO(對照組)和10、20、40 μmol/L 6-Paradol處理48 h后HCCC 9810細胞(t值分別為2.99、3.52、6.44，P值均<0.05)及HUCCT1細胞(t值分別為3.90、11.40、7.72，P值均<0.05)中p-STAT3的相對表達量均隨著藥物濃度的增加逐漸減少(圖4c、d)；而SRC和p-mTOR蛋白的相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。因此推測6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞增殖及遷移侵襲的抑制作用是通過靶向STAT3實現(xiàn)的。進一步對STAT3下游可能的6-Paradol作用位點進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p21在HCCC 9810(t值分別為3.79、13.82、3.18，P值均<0.05)和HUCCT1細胞(t值分別為10.10、11.71、5.93，P值均<0.05)中的相對表達量隨著藥物濃度的增加明顯增加，而Bcl-2的蛋白表達量無明顯差異(P值均>0.05)(圖4e、f)。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)p21對腫瘤演變的影響在很大程度上還取決于p53蛋白在癌細胞中的狀態(tài)，于是對細胞中p53的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)p53均呈現(xiàn)穩(wěn)定表達的狀態(tài)(圖4e、f)。上述結(jié)果表明，6-Paradol可能通過作用于STAT3-p21通路來發(fā)揮對人HCCC 9810和HUCCT1細胞增殖及遷移侵襲的抑制作用。

注：a、b，CCK-8實驗；c，平板克隆實驗。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

注：a、c，劃痕愈合實驗；b、d，Transwell小室實驗(×100)。圖2 不同濃度6-Paradol對人HCCC 9810和HUCCT1細胞遷移、侵襲能力的影響

注：a，6-Paradol的結(jié)構(gòu)；b，6-Paradol作用的蛋白靶點預(yù)測及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。圖3 6-Paradol的結(jié)構(gòu)及其作用的蛋白靶點預(yù)測及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

注：a,6-Paradol處理后HCCC 9810細胞中STAT3、p-mTOR蛋白表達量；b, 6-Paradol處理后HUCCT1細胞中STAT3、p-mTOR蛋白表達量；c,6-Paradol處理后HCCC 9810細胞中p-STAT3、SRC蛋白表達量；d, 6-Paradol處理后HUCCT1細胞中p-STAT3、SRC蛋白表達量；e, 6-Paradol處理后HCCC 9810細胞中p21、Bcl-2、p53蛋白表達量； f, 6-Paradol處理后HUCCT1細胞中p21、Bcl-2、p53蛋白表達量。

2.5 DARTS研究6-Paradol與STAT3間的相互作用 對6-Paradol 和STAT3的相互作用進行DARTS研究，結(jié)果顯示(圖5)，與對照組相比，6-Paradol及鏈霉菌蛋白酶處理組的HCCC 9810和HUCCT1細胞中STAT3被蛋白酶水解的比例分別減少了48.66%、45.33%(t值分別為16.64、8.76,P值均<0.05)，表明STAT3可以與6-Paradol結(jié)合從而在一定程度上使其免于被蛋白酶水解。

2.6 通過質(zhì)粒在膽管癌細胞中過表達STAT3以及敲低p21的表達 為了進一步論證6-Paradol通過STAT3-p21通路對HCCC 9810和HUCCT1細胞的增殖、遷移侵襲發(fā)揮抑制作用，運用質(zhì)粒分別過表達了STAT3以及敲低了p21的表達，qRT-PCR結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染過表達STAT3質(zhì)粒后，與對照組相比，HCCC 9810和HUCCT1細胞中STAT3的表達量顯著提升(t值分別為2.82、5.60，P值均<0.05)(圖6a);轉(zhuǎn)染sh-p21質(zhì)粒后，與對照組相比，HCCC 9810和HUCCT1細胞中p21的表達量顯著降低(t值分別為6.84、3.91，P值均<0.05)(圖6b)。

2.7 6-Paradol通過STAT3-p21通路對HCCC 9810和HUCCT1細胞的增殖及遷移侵襲的抑制作用 CCK-8實驗結(jié)果顯示(圖7a、b)，與單獨加藥組相比，過表達STAT3或沉默p21均可部分逆轉(zhuǎn)6-Paradol對細胞增殖的抑制作用(P值均<0.05)；劃痕實驗結(jié)果表明(圖7c、d)，在過表達STAT3的HCCC 9810及HUCCT1細胞中，與單獨給藥組(6-Paradol：40 μmol/L)相比，劃痕愈合率分別提升了67.83%、53.15%(t值分別為4.51、5.54，P值均<0.05)；在沉默p21表達的HCCC 9810及HUCCT1細胞中，與單獨給藥組相比，劃痕愈合率分別提升了61.80%、108.3%(t值分別為5.41、6.09，P值均<0.05)；Transwell實驗結(jié)果表明(圖7e、f)，在過表達STAT3的HCCC 9810及HUCCT1細胞中，與單獨給藥組(6-Paradol：40 μmol/L)相比，細胞遷移過膜細胞數(shù)分別提升了56.15%、88.20%(t值分別為4.28、18.81，P值均<0.05)；在沉默p21表達的HCCC 9810及HUCCT1細胞中， 與單獨給藥組相比， 細胞遷移過膜細胞數(shù)分別提升了30.17%、15.40%(t值分別為2.80、2.90，P值均<0.05)；在過表達STAT3的HCCC 9810及HUCCT1細胞中，與單獨給藥組(6-Paradol：40 μmol/L)相比，細胞侵襲過膜細胞數(shù)分別提升了82.82%、62.38%(t值分別為10.56、10.05，P值均<0.05)；在沉默p21表達的HCCC 9810及HUCCT1細胞中，與單獨給藥組相比，細胞侵襲過膜細胞數(shù)分別提升了16.80%、20.53%(t值分別為2.82、3.79，P值均<0.05)。以上結(jié)果證實，6-Paradol通過靶向作用于STAT3-p21通路對HCCC 9810和HUCCT1細胞的增殖以及遷移侵襲發(fā)揮抑制作用。

注：a、b、c, DARTS探究HCCC 9810細胞中6-Paradol與STAT3的相互作用；d、e、f，DARTS探究HUCCT1細胞中6-Paradol與STAT3 的相互作用。***P<0.001。圖5 DARTS探究6-Paradol與STAT3的相互作用Figure 5 DARTS was used to explore the interaction between 6-Paradol and STAT3

注：*P<0.05, **P<0.01。圖6 qRT-PCR驗證STAT3過表達質(zhì)粒及sh-p21質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率

3 討論

ICC治療方式有限且預(yù)后較差，大多數(shù)病例診斷時已是晚期，并且只有約三分之一的患者適合手術(shù)切除[2]，因此尋找新型的藥物協(xié)助ICC的治療是目前亟待解決的問題。

6-Paradol是一種天然酚類化合物，一些體內(nèi)、體外研究均發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗腫瘤作用[9]。Li等[10]證實6-Paradol通過調(diào)控MAPK信號通路抑制肝癌細胞增殖和遷移并誘導細胞發(fā)生凋亡和G0/G1期細胞阻滯；也有研究[9]表明6-Paradol可顯著降低DMBA誘導的小鼠皮膚腫瘤的發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)，在CCK-8實驗中，6-Paradol對人HCCC 9810和HUCCT1細胞有明顯的細胞毒性作用，并呈現(xiàn)時間和濃度依賴性；通過平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)6-Paradol對ICC細胞的克隆形成能力有明顯的抑制作用；在劃痕實驗及Transwell實驗中觀察到6-Paradol對ICC細胞的遷移侵襲也有明顯的抑制作用。以上結(jié)果均提示6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞具有顯著的抗腫瘤作用。

STAT3對于轉(zhuǎn)導癌細胞中的受體和/或非受體酪氨酸激酶活化的信號以及調(diào)節(jié)眾多促進腫瘤進展的基因表達的轉(zhuǎn)錄因子是不可或缺的[11]。STAT3的信號級聯(lián)反應(yīng)通過上游激酶的信號所觸發(fā)，并經(jīng)歷磷酸化、同型二聚化、轉(zhuǎn)位到細胞核并與DNA結(jié)合，從而影響腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成及免疫編輯等過程中的目的基因表達[7]。STAT3的過度活化已被報道存在于多種類型的腫瘤中，比如肝[12]、胰腺[13]、卵巢癌[14]等，并且在這些

注：a、b，CCK-8實驗檢驗細胞增殖能力；c、d，劃痕實驗；e、f，Transwell小室實驗(×100)；***P<0.001。圖7 6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞增殖及遷移、侵襲的抑制作用Figure 7 Inhibitory effect of 6-Paradol on the proliferation, migration and invasion of HCCC 9810 and HUCCT1 cells

腫瘤中，活化的STAT3表達水平與不良預(yù)后呈正相關(guān)。鑒于STAT3的異常激活為參與腫瘤細胞增殖、血管生成、遷移和侵襲的腫瘤轉(zhuǎn)移提供了有利條件以及STAT3信號傳導是腫瘤微環(huán)境中免疫逃逸的誘因，因此靶向STAT3可抑制腫瘤進展并改善抗腫瘤免疫反應(yīng)。本實驗中，Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，6-Paradol處理組細胞中STAT3蛋白的相對表達量明顯減少且藥物處理組中人膽管癌細胞的增殖、克隆形成、遷移侵襲能力均弱于對照組，提示6-Paradol可能通過靶向STAT3發(fā)揮了腫瘤抑制作用，筆者進一步對STAT3過表達的膽管癌細胞進行了藥物處理(6-Paradol：40 μmol/L),結(jié)果通過功能實驗發(fā)現(xiàn)膽管癌細胞的增殖及遷移侵襲能力得到了部分恢復(fù)，從而論證了6-Paradol可能通過靶向STAT3發(fā)揮其腫瘤抑制作用。

p21由CDKN1A基因編碼，是CDK2的主要抑制劑，因此也被稱為CDKN1A或CDK相互作用蛋白1[15],除了在細胞周期調(diào)節(jié)中的作用外，p21還參與了細胞分化、遷移侵襲、細胞骨架動力學、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、DNA 修復(fù)等功能[16]。既往研究[17]表明，p53的狀態(tài)是p21特性和活性的主要決定因素，即p21在p53富集的環(huán)境中起抑癌作用，而在p53缺乏的環(huán)境中則促進腫瘤發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，隨著6-Paradol濃度的逐漸遞增，膽管癌HCCC 9810和HUCCT1細胞中p21的表達量呈現(xiàn)遞增的趨勢，且p53呈現(xiàn)穩(wěn)定表達的狀態(tài)，表明6-Paradol可能通過調(diào)節(jié)p21發(fā)揮其腫瘤抑制作用。通過沉默p21后行CCK-8、劃痕愈合及Transwell實驗，進一步論證了此猜想。

在本研究中，首先發(fā)現(xiàn)6-Paradol對HCCC 9810和HUCCT1細胞的增殖、遷移及侵襲具有明顯的抑制作用，并且6-Paradol對膽管癌細胞的毒性作用呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。然后通過生物信息學分析篩選出6-Paradol最有可能的蛋白作用靶點后，采用Western blot進行驗證發(fā)現(xiàn)，隨著6-Paradol濃度的逐漸遞增，膽管癌細胞中STAT3及p-STAT3的表達量呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢，表明6-Paradol可抑制膽管癌細胞中STAT3及p-STAT3的表達。然后對JAK-STAT信號通路下游可能的作用位點進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p21蛋白的表達呈現(xiàn)遞增的趨勢，而其他下游位點均無明顯的變化趨勢。然后通過CCK-8、劃痕愈合及Transwell實驗論證了上述猜想。據(jù)以上結(jié)果可推斷,6-Paradol通過靶向作用于STAT3-p21通路介導對HCCC 9810和HUCCT1細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：陳澤昊對于研究的思路或設(shè)計有關(guān)鍵貢獻；陳澤昊、朱文杰參與了研究數(shù)據(jù)的獲取及分析解釋；陳澤昊、申兵兵參與起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；江建新參與文章的審閱及批改。