張煒琪， 謝 炎,， 陳池義， 賀 健,， 譚玉瑩， 黃亞北， 張 驪， 蔣文濤

1 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院， 天津 300070； 2 天津市第一中心醫(yī)院 肝移植科， 天津 300192

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上第六大常見(jiàn)癌癥，并且是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。肝移植是治療HCC最有效的方法之一，對(duì)于符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)的患者，肝移植術(shù)后5年存活率可達(dá)70%[2-3]。但米蘭標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于患者的要求較為苛刻，為了擴(kuò)大受益人群，超米蘭標(biāo)準(zhǔn)肝癌肝移植患者的數(shù)量逐漸增加，這同時(shí)也增加肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

腫瘤復(fù)發(fā)是患者肝移植術(shù)后死亡的常見(jiàn)原因之一，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[4-5]。已有研究[6-8]表明，腫瘤的病理特征以及患者血清甲胎蛋白(AFP)對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有重要提示作用。此外，全身炎癥反應(yīng)可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞因子促進(jìn)血管生成、DNA損傷和腫瘤侵襲[9-11]，因此中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio, NLR)作為一種簡(jiǎn)單的炎癥指標(biāo)，與HCC患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的聯(lián)系也越來(lái)越被人們所認(rèn)可[12-13]。本研究的目的是根據(jù)患者術(shù)前及術(shù)后相關(guān)指標(biāo)建立一個(gè)預(yù)測(cè)超米蘭標(biāo)準(zhǔn)HCC患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的模型，用于評(píng)估超米蘭標(biāo)準(zhǔn)HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，以便合理指導(dǎo)治療。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2014年8月—2018年7月在天津市第一中心醫(yī)院接受首次原位肝移植的超米蘭標(biāo)準(zhǔn)HCC患者的臨床資料。所有患者術(shù)前均根據(jù)影像學(xué)檢查排除大血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，HCC的診斷由術(shù)后病理得出。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡在18～70歲；首次原位肝移植；術(shù)前未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及大血管侵犯；術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為超米蘭標(biāo)準(zhǔn)的HCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：混合性肝癌；多器官聯(lián)合移植；術(shù)前合并其他部位的腫瘤；臨床及病理資料缺失。

1.3 研究方法

1.3.1 手術(shù)和術(shù)后管理 所有患者均接受公民逝世后器官捐獻(xiàn)的ABO血型相合的供肝，并由相同經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行原位肝移植。術(shù)后采用三聯(lián)免疫抑制方案，包括他克莫司 (FK506)、霉酚酸酯(MMF)和激素。術(shù)中及術(shù)后第4天加用巴利昔單抗20 mg。術(shù)后3個(gè)月開(kāi)始加用雷帕霉素并適當(dāng)將FK506減量，使雷帕霉素和FK506的血藥濃度分別維持在5～8 μg/L和2～3 μg/L，此時(shí)密切監(jiān)測(cè)患者血常規(guī)、肝功能等指標(biāo)以早期發(fā)現(xiàn)可能的排斥反應(yīng)，根據(jù)患者具體情況決定是否需要加用嗎替麥考酚酯。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)，停用FK506，單用雷帕霉素并使其血藥濃度維持在5～8 μg/L。

1.3.2 病理檢查及免疫組化染色 術(shù)后病理檢查及免疫組化染色由兩位病理學(xué)專(zhuān)家進(jìn)行盲法評(píng)估。如果兩位病理學(xué)專(zhuān)家初始評(píng)估不一致，則重新評(píng)估結(jié)果至達(dá)成共識(shí)。

1.3.3 隨訪(fǎng) 采用門(mén)診或電話(huà)方式進(jìn)行隨訪(fǎng)。術(shù)后2年內(nèi)每2個(gè)月隨訪(fǎng)1次，此后每6個(gè)月隨訪(fǎng)1次。隨訪(fǎng)期間常規(guī)行影像學(xué)及檢驗(yàn)學(xué)檢查。當(dāng)懷疑轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)時(shí)，則通過(guò)MRI或增強(qiáng)CT進(jìn)一步評(píng)估。主要觀察終點(diǎn)是肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)。無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間定義為肝移植至腫瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間，對(duì)于中途失訪(fǎng)或死亡的患者，則為肝移植至最后一次隨訪(fǎng)的時(shí)間?？傮w生存時(shí)間定義為肝移植至患者死亡的時(shí)間，對(duì)于中途失訪(fǎng)的患者，則為肝移植至最后一次隨訪(fǎng)的時(shí)間。隨訪(fǎng)截止日期為2021年7月31日。根據(jù)隨訪(fǎng)期間腫瘤是否復(fù)發(fā)，將患者分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 患者基線(xiàn)資料見(jiàn)表1。本研究共納入117例患者，其中男104例，女13例，平均(54.28±9.52)歲，共42例(35.9%)患者在隨訪(fǎng)期間死亡，46例患者中途失訪(fǎng)，中位隨訪(fǎng)時(shí)間24(1～74)個(gè)月。術(shù)后3年生存率為53.1%，術(shù)后5年生存率為49.0%。53例(45.3%)患者術(shù)后復(fù)發(fā)，其中52例(98.1%)于術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為6(1～52)個(gè)月。其中3例患者在將免疫抑制劑轉(zhuǎn)為雷帕霉素時(shí)肝功能發(fā)生輕度異常，經(jīng)多學(xué)科會(huì)診討論后考慮輕度排斥反應(yīng)，在予以加用嗎替麥考酚酯及保肝等對(duì)癥治療后，肝功能逐步恢復(fù)正常。

2.2 單因素Cox回歸分析結(jié)果 患者年齡、腫瘤最大直徑、術(shù)前血清AFP、NLR、KLI的最佳截?cái)嘀捣謩e為54歲(AUC=0.638，95%CI：0.544～0.725，P=0.007)、5 cm(AUC=0.710，95%CI: 0.619～0.790,P<0.001)、769 ng/mL(AUC=0.726，95%CI：0.636～0.804，P<0.001)、3.75(AUC=0.715，95%CI：0.624～0.795，P<0.001)、0.25(AUC=0.712，95%CI：0.621～0.792，P<0.001)(圖1)。其中MELD評(píng)分(AUC=0.507，95%CI:0.413～0.601,P=0.898)對(duì)于術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)能力較差，且MELD評(píng)分常被用來(lái)評(píng)估受者術(shù)后存活情況，故該因子被排除在外，未做進(jìn)一步分析。單因素分析顯示，腫瘤最大直徑>5 cm、衛(wèi)星灶、門(mén)靜脈癌栓、微血管侵犯、AFP>769 ng/mL、NLR>3.75、免疫組化染色AFP、CK19陽(yáng)性以及 KLI>0.25均是影響患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間的因素(P值均<0.05)(表2)。

表1 117例患者的一般資料Table 1 The general data of 117 patients

2.3 多因素Cox回歸分析篩選模型變量 在將上述9個(gè)變量進(jìn)行多變量分析之前，對(duì)預(yù)測(cè)變量進(jìn)行了多重共線(xiàn)性評(píng)估。各組間方差膨脹因子均小于10，容忍度大于0.2，說(shuō)明各因素之間不存在共線(xiàn)性問(wèn)題[15]。隨后將上述9個(gè)指標(biāo)納入多因素分析。Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示只有KLI>0.25、術(shù)前血清AFP>769 ng/mL，NLR>3.75是影響患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)(表2)。

2.4 建立模型 根據(jù)多因素Cox回歸分析的結(jié)果，用KLI、AFP、NLR三個(gè)因子構(gòu)建肝移植術(shù)后HCC復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型。根據(jù)每個(gè)因子的β系數(shù)賦予相應(yīng)得分。KLI>0.23得1分，AFP>769 ng/mL和NLR>3.75分別得1.5分，其余均得0分，將所得評(píng)分相加即為總分，個(gè)人總分為4分(表3)。Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)顯示P=0.184，說(shuō)明該模型擬合優(yōu)度良好。模型AUC為0.843(95%CI:0.764～0.903,P<0.001)，最佳截?cái)嘀禐?.25，具有良好的靈敏度(88.7%)及特異度(70.3%)(圖2)。

比較不同得分之間的無(wú)復(fù)發(fā)生存率發(fā)現(xiàn)，得分0～1分的患者具有較低的復(fù)發(fā)率以及較好的無(wú)復(fù)發(fā)生存率，而1.5～4分的患者復(fù)發(fā)率較高，無(wú)復(fù)發(fā)生存率較低。因此將患者分為低危組(0～1分)和高危組(1.5～4分)，log-rank檢驗(yàn)顯示高危組患者術(shù)后3年、5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率(10.9%、10.9%)明顯低于低危組患者(84.1%、72.0%)(χ2=29.425，P<0.001)。比較這兩組患者的總體生存率，發(fā)現(xiàn)高危組患者術(shù)后3年、5年總生存率(36.8%、36.8%)也明顯低于低危組患者(81.9%、74.5%)(χ2=14.800，P<0.001)(圖3)。

表2 單因素及多因素Cox回歸分析結(jié)果Table 2 The results of univariate and multivariate Cox regression analysis

圖2 新HCC復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)能力Figure 2 The performance of the new model for predicting HCC recurrence表3 基于多因素Cox回歸分析β系數(shù)的模型得分Table 3 The score of the model based on β coefficient ofmultivariate Cox regression analysis

變量β系數(shù)得分AFP>769 ng/mL1.4881.5NLR>3.751.3551.5KLI>0.250.9771.0

3 討論

超米蘭標(biāo)準(zhǔn)HCC患者肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)使其預(yù)后不能令人滿(mǎn)意?，F(xiàn)有研究[16]報(bào)道了多種與肝移植術(shù)后HCC復(fù)發(fā)有關(guān)的檢驗(yàn)學(xué)及病理學(xué)參數(shù)。Ma等[17]發(fā)現(xiàn)腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤最大直徑以及術(shù)前AFP水平等指標(biāo)與HCC復(fù)發(fā)有關(guān)，并將其納入到模型構(gòu)建中，獲得了比單一因素更為有效的預(yù)測(cè)模型。Shimamura等[18]根據(jù)影像學(xué)及血清學(xué)檢查使用血清AFP、腫瘤直徑及個(gè)數(shù)等指標(biāo)也構(gòu)建了一個(gè)評(píng)價(jià)效果良好的模型。但這兩種模型均不是針對(duì)超米蘭標(biāo)準(zhǔn)HCC的患者。本研究根據(jù)患者術(shù)前NLR、AFP水平以及KLI，構(gòu)建了一個(gè)針對(duì)超米蘭標(biāo)準(zhǔn)HCC患者的預(yù)測(cè)模型且預(yù)測(cè)效能良好。

術(shù)前高NLR反映出機(jī)體的低淋巴細(xì)胞和高中性粒細(xì)胞狀態(tài)。前者表明機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)較差，后者反映了VEGF的水平，而VEGF與腫瘤血管生成及腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[12]。術(shù)前高NLR已被證明與多種實(shí)體腫瘤的不良生存結(jié)果相關(guān)[19-21]。在Motomura等[12]的研究中，無(wú)論HCC患者是否符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)，NLR≥4的患者活體肝移植術(shù)后5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率均低于NLR<4的患者。術(shù)前高NLR是影響患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素。

注：a，術(shù)前血清AFP；b，年齡；c，腫瘤最大直徑；d，KLI；e，MELD評(píng)分；f，NLR。

AFP用于肝癌的診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)已有數(shù)十年的歷史[22]?，F(xiàn)有研究也表明，AFP水平是肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，其預(yù)測(cè)HCC復(fù)發(fā)的能力也在多種預(yù)測(cè)模型中被強(qiáng)調(diào)[18,23-26]。但在不同的研究中，AFP水平預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)的截?cái)嘀凳遣煌?。本研究根?jù)ROC曲線(xiàn)取得的最佳截?cái)嘀的芎芎玫膶⒉煌幕颊邊^(qū)分開(kāi)。但僅考慮AFP顯然是不夠的，筆者納入了包括AFP在內(nèi)的3個(gè)腫瘤相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測(cè)價(jià)值要優(yōu)于單一AFP。

Ki67是一種核蛋白，被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的敏感標(biāo)志，反映了惡性腫瘤細(xì)胞的比例，與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)[27-28]。多項(xiàng)研究[29-32]發(fā)現(xiàn)，高KLI在前列腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌等多種癌癥中與患者的預(yù)后密切相關(guān)。在HCC中，ki67的表達(dá)被認(rèn)為與肝癌細(xì)胞的增殖和惡性生物學(xué)活性有關(guān)，并且高KLI的肝癌易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。然而，關(guān)于ki67的表達(dá)與HCC患者肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)研究較少。Zhang等[7]雖然發(fā)現(xiàn)腫瘤組織ki67陽(yáng)性與肝移植術(shù)后HCC復(fù)發(fā)相關(guān)，但他并沒(méi)有給出KLI，也沒(méi)有量化ki67與肝移植術(shù)后HCC復(fù)發(fā)的關(guān)系。本研究根據(jù)免疫組化評(píng)估KLI，找到了能將不同危險(xiǎn)程度的患者區(qū)分開(kāi)的最佳截?cái)嘀?，并且發(fā)現(xiàn)KLI>0.25是肝移植術(shù)后HCC復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素。隨后將其納入到預(yù)測(cè)模型中，并取得了良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

圖3 兩組患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率與總體生存率比較Figure 3 The comparison of recurrence-free survival and overall survival between the two groups

本研究也存在一定的局限性。首先本研究是一項(xiàng)單中心、回顧性研究，且大部分患者病因都是乙型肝炎，這可能會(huì)造成一定的選擇偏倚。其次由于樣本量的限制，也使得本研究的結(jié)果需要更多的外部樣本量來(lái)驗(yàn)證。

總之，超米蘭標(biāo)準(zhǔn)的肝癌肝移植要慎重進(jìn)行，本研究根據(jù)患者術(shù)前NLR、AFP水平以及KLI建立了一個(gè)有效預(yù)測(cè)此類(lèi)患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的模型，有助于更精準(zhǔn)地把握此類(lèi)患者的肝移植指征，并為肝移植術(shù)后的隨訪(fǎng)和治療提供一定的參考。

倫理學(xué)聲明：本研究于2021年8月17日經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：2021N071KY。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張煒琪負(fù)責(zé)資料收集，數(shù)據(jù)分析及文章撰寫(xiě)；蔣文濤負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，研究指導(dǎo)，審校并最終定稿；謝炎、陳池義、賀健、譚玉瑩、黃亞北、張?bào)P參與數(shù)據(jù)收集和分析。