許 皓， 阮 柏,2， 歷志文， 房志強， 王 琳， 竇科峰

1 空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 肝膽胰脾外科， 西安 710032；2 空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系 航空航天臨床醫(yī)學中心， 西安 710032

肝纖維化是各種慢性肝損傷的共同病理改變，也是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)環(huán)節(jié)。其病理特征是肌纖維母細胞產(chǎn)生大量肝內(nèi)細胞外基質(zhì)(ECM)，并過度沉積在纖維間隔和竇周間隙，導致正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和異常血管重建[1]。以往研究[2-3]普遍認為，活化的肝星狀細胞(HSC)是纖維化肝臟中肌纖維母細胞的主要來源。

α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)是公認的間質(zhì)樣細胞標志物。近年來，研究者通過遺傳示蹤技術(shù)在實體器官纖維化模型中證明，一部分血管內(nèi)皮細胞能夠轉(zhuǎn)分化為α-SMA+的肌纖維母細胞，進而產(chǎn)生ECM并參與各器官的纖維化進展[4-5]。肝臟組織特異性的血管內(nèi)皮——肝血竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)在肝損傷病理條件下也會發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化，即由內(nèi)皮細胞向間質(zhì)樣細胞特征轉(zhuǎn)變。在此過程中，LSEC不僅表達間質(zhì)樣細胞標志物，同時也會產(chǎn)生ECM并參與肝臟血竇區(qū)的膠原沉積和纖維化形成[6]。

tdTomato熒光蛋白(tandem-dimer tomato，tdTomato)和增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)作為穩(wěn)定的熒光標記物，已廣泛應用于轉(zhuǎn)基因小鼠品系構(gòu)建和細胞標記實驗。利用熒光蛋白標記α-SMA，可特異性反映細胞發(fā)生間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化的情況。同時，利用Cre/Loxp系統(tǒng)介導的他莫昔芬可誘導條件性基因敲除技術(shù)，Cre重組酶可在成體細胞中特異性識別兩個Loxp位點間的序列，發(fā)生特異性基因片段刪除的“剪切效應”，實現(xiàn)特定種類細胞的靶基因敲除[7-8]。本研究設計構(gòu)建了一種Acta2-Knockin(KI)熒光示蹤基因敲入小鼠，該基因全長包含9個外顯子(圖1)，構(gòu)建策略是在第2個外顯子的下游內(nèi)含子區(qū)插入Loxp-tdTomato-STOP-Loxp-eGFP片段。再與內(nèi)皮特異性Cdh5-CreERT工具鼠進行雜交，最終構(gòu)建出Cdh5-CreERT/Acta2-KI遺傳示蹤小鼠，當他莫昔芬誘導Cre重組酶激活時，成體小鼠血管內(nèi)皮細胞中tdTomato和STOP終止子序列將被Cre/Loxp系統(tǒng)切除，形成移碼突變，此時若內(nèi)皮細胞表達Acta2，則會翻譯表達eGFP。

圖1 Cdh5-CreERT/Acta2小鼠的構(gòu)建策略與作用機制Figure 1 Establishing strategy and mechanism of Cdh5-CreERT/Acta2 mice

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ECM培養(yǎng)基套裝(Sciencell：1001)、CCl4(天津富宇：04519)、橄欖油(國藥集團：69018028)、他莫昔芬(Sigma：T5648)、玉米油(Sigma：C8267)、鼠尾直接PCR試劑盒(成都福際：TP-01331)、OCT包埋劑(Sakura：4583)、免疫熒光封閉液(碧云天：P0260)、免疫染色一抗/二抗稀釋液(碧云天：P0262/P0265)、Hoechst33342(Thermo：H3570)、兔源性RFP抗體(Abcam：ab62341)、小鼠源性eGFP抗體(Abcam：ab6673)、驢抗兔熒光二抗(Invitrogen：A-21206)、驢抗小鼠熒光二抗(Invitrogen：A-21202)等。

1.2 示蹤小鼠的構(gòu)建與繁育 本實驗所用遺傳示蹤小鼠的構(gòu)建策略如圖1所示。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建基于Acta2基因的Loxp-tdTomato-STOP-Loxp-eGFP基因敲入(Acta2-KI)小鼠，并與本實驗室繁育的Cdh5-CreERT工具鼠雜交。選取Cdh5-CreERT+且Acta2-KI雜合或純合小鼠作為目標示蹤Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠進行后續(xù)實驗分析。實驗用小鼠均在SPF級動物實驗室內(nèi)飼養(yǎng)[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)-2017-0021，實驗動物使用許可證號：SYXK(軍)-2017-0044]，每天光照12 h，溫度20 ℃～25 ℃，濕度50%～60%。

1.3 小鼠基因組DNA提取與基因型鑒定 小鼠基因組DNA的提取按鼠尾直接PCR試劑盒說明書進行。分別剪取子代小鼠尾尖約0.5 cm于離心管中，每管加入4 μL Foregene Protease Plus和100 μL Buffer MP，渦旋混勻。65 ℃金屬浴孵育30 min后，95 ℃孵育5 min。12000 r/min離心5 min，取上清至新的離心管中。

將提取的Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠基因組DNA進行PCR擴增并鑒定其基因型，PCR引物見表1。PCR反應20 μL體系包括：基因組DNA模板2 μL，上、下游引物(10 nmol/L)各0.5 μL，2×Taq MasterMix(Dye)10 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。取10 μL PCR終產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖核酸凝膠電泳。后置于凝膠電泳儀中成像并分析。

表1 PCR擴增引物Table 1 PCR amplification primer

1.4 他莫昔芬誘導方案與肝纖維化模型建立 經(jīng)PCR基因型鑒定，得到Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠，待小鼠6～8周齡時，開始他莫昔芬誘導。用玉米油配制他莫昔芬終濃度為20 μg/μL，按100 μL/只劑量，腹腔注射連續(xù)5 d(1次/d)，共5次，誘導Cre重組酶激活。再靜置1周后，用橄欖油配制15%CCl4，按4 μL/g體質(zhì)量劑量，腹腔注射連續(xù)6周(2次/周)，共12次，誘導小鼠形成肝纖維化病變，完成后取材。

1.5 小鼠肝臟組織處理 腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，20 mL生理鹽水灌注左心室，同時剪開右心耳，剝離肝臟，剪取部分肝葉，4%多聚甲醛固定30 min，30%蔗糖PBS溶液4 ℃過夜脫水，次日以OCT包埋，-80 ℃凍存小鼠肝臟組織包埋塊，于冰凍切片機上切片，片厚8 μm。

1.6 小鼠原代LSEC分離與培養(yǎng) 參考本實驗室既往研究[9]報道的實驗方法分離小鼠原代LSEC。采用膠原酶兩步灌注法對小鼠肝臟進行消化，組織處理器勻漿消化，篩網(wǎng)過濾，反復50×g低速離心去除細胞懸液中的肝細胞，獲得的細胞懸液用400×g離心7 min收集細胞沉淀，通過OptiPrep密度梯度離心獲取上層HSC，通過CD146免疫磁珠進一步分選獲得LSEC。

將新鮮分離出的LSEC用ECM培養(yǎng)基(含胎牛血清、雙抗)重懸，接種于鋪好細胞爬片的24孔板中，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，4～5 h后倒置顯微鏡下觀察細胞是否貼壁，對貼壁后的細胞換液，此后每2 d換液1次，7 d后鏡下觀察。待LSEC發(fā)生間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化后，用1×PBS緩沖液洗5 min，4%多聚甲醛固定15 min后染色觀察。

1.7 免疫熒光染色 小鼠肝臟組織冰凍切片上滴加免疫熒光染色封閉液，于濕盒內(nèi)室溫封閉1 h，將稀釋后的抗RFP和GFP一抗(稀釋比1∶200)滴加在組織上，濕盒4 ℃過夜；次日，用對應稀釋后熒光二抗(稀釋比1∶300)室溫避光染色2 h，Hoechst33342染核10 min，50%緩沖甘油封片，4 ℃保存。原代LSEC細胞爬片的免疫熒光染色步驟，類同此法。用激光共聚焦顯微鏡分別觀察組織、細胞樣本中熒光蛋白tdTomato(紅色)和eGFP(綠色)的表達。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果 小鼠基因型檢測結(jié)果顯示：Cdh5-CreERT、Acta2-KI突變型、Acta2-KI野生型小鼠PCR分別擴增出900 bp、1663 bp、301 bp的目的條帶，綜合三種瓊脂糖核酸凝膠電泳分析結(jié)果，即可鑒定小鼠基因型。2、4號(擴增出900 bp、1663 bp、301 bp條帶)為Cdh5-CreERT+/Acta2-KI+/-雜合小鼠，5號(擴增出900 bp、1663 bp條帶)為Cdh5-CreERT+/Acta2-KI+/+純合小鼠，3、7、8號(擴增出900 bp、301 bp條帶)為Cdh5-CreERT+/Acta2-KI-野生型小鼠(圖2)。

注：(A)為 Cdh5-CreERT條帶；(B) 為Acta2-KI突變型條帶； (C) 為Acta2-KI野生型條帶。

2.2 體外轉(zhuǎn)分化模型中熒光示蹤 研究表明，體外培養(yǎng)的HSC會發(fā)生細胞形變，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加逐步趨向肌纖維母細胞的特性。為從細胞水平闡明LSEC向肌纖維母細胞樣細胞轉(zhuǎn)分化的能力，取健康7～9周齡未經(jīng)他莫昔芬誘導、誘導完成后的Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠，分離原代LSEC和HSC，在體外培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察其培養(yǎng)不同天數(shù)后的形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)3 d時，部分LSEC已由最初的卵圓形變?yōu)殚L梭形，繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，細胞體積變大，細胞邊緣向周圍伸展生成較多偽足，7 d時外形特征已近似肌纖維母細胞，提示LSEC在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化。在體外培養(yǎng)7 d后，進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示(圖3)：(1)免疫染色陰性對照組，LSEC無顯著的紅色

圖3 體外培養(yǎng)7 d后LSEC和HSC的免疫熒光染色Figure 3 Immunofluorescent staining of LSEC and HSC after 7 d culture in vitro

圖4 CCl4誘導肝纖維化模型肝臟組織免疫熒光染色Figure 4 Immunofluorescent staining of liver tissue for CCl4 induced fibrotic model

熒光(tdTomato)和綠色熒光(eGFP)，HSC經(jīng)活化后產(chǎn)生較顯著的紅色熒光；(2)未經(jīng)他莫昔芬誘導組經(jīng)免疫染色后，LSEC和HSC均表達紅色熒光；(3)他莫昔芬誘導組經(jīng)免疫染色后，LSEC出現(xiàn)明顯的綠色熒光，說明Cre/LoxP系統(tǒng)在他莫昔芬的誘導下產(chǎn)生了“基因剪切”效應，表達出eGFP，即LSEC轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細胞樣細胞。

2.3 肝纖維化模型的熒光示蹤 為進一步驗證該遺傳示蹤小鼠的可靠性，分別選取7～9周齡未經(jīng)他莫昔芬誘導和誘導完成后的Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠，同時用CCl4造模6周，取肝臟組織制作冰凍切片，對LSEC進行免疫熒光染色。結(jié)果顯示(圖4)：未誘導組肝臟切片可見明顯的紅色熒光，但未出現(xiàn)綠色熒光；而經(jīng)他莫昔芬誘導組除了紅色熒光，同時可見部分區(qū)域表達綠色熒光。這說明在肝纖維化過程中，部分LSEC確實發(fā)生了內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化。

3 討論

幾乎各種慢性肝病的誘因均可引起肝纖維化。多種損傷因素刺激下，肝臟產(chǎn)生慢性炎癥并反復發(fā)作，經(jīng)過長期的自我修復，最終限制正常的肝再生，增加肝功能衰竭的風險，逐漸形成難以恢復的肝硬化[10]。從細胞層面來看，肝纖維化過程中，除肝細胞變形、凋亡甚至壞死，各類炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的刺激外，肝內(nèi)多種被激活的非實質(zhì)細胞均有可能轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞，產(chǎn)生ECM并在肝臟中大量沉積[1,11]。及時逆轉(zhuǎn)早期形成的纖維化，是近幾十年來公認的能夠有效阻止肝硬化發(fā)生的治療策略[12]。

以往研究普遍認為活化的HSC是轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞的主要來源細胞。近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化廣泛存在于心[13]、腎[14]、肺[15]等器官的纖維化過程中。研究者[4-5]通過遺傳示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)部分血管內(nèi)皮細胞在纖維化中可轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細胞并參與器官的纖維化進展。前期研究表明，無論在體內(nèi)外，LSEC均能夠發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化并分泌膠原且表達間質(zhì)樣標志物(如α-SMA等)，證實了部分LSEC在纖維化條件下能夠獲得間質(zhì)樣特征[6]。但之前的研究仍缺乏較準確的遺傳學示蹤證據(jù)。

本研究建立的Cdh5-CreERT/Acta2-KI遺傳示蹤模型小鼠，利用內(nèi)皮特異性Cre/Loxp重組酶系統(tǒng)和CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，實現(xiàn)了對內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化LSEC的特異性熒光標記。經(jīng)他莫昔芬誘導，Cre重組酶被激活，進入細胞核內(nèi)與Acta2基因的Loxp-tdTomato-STOP-Loxp位點結(jié)合，使由LSEC轉(zhuǎn)分化而來的肌纖維母細胞表達綠色熒光蛋白(eGFP)。而其他來源的肌纖維母細胞因不能激活內(nèi)皮特異性的Cdh5-CreERT發(fā)揮“剪切效應”，故翻譯tdTomato后在STOP終止子處停止，因此僅表達紅色熒光蛋白(tdTomato)。綜上，可達到對LSEC來源肌纖維母細胞特異性示蹤的目的。

在此基礎上，本研究通過原代LSEC體外培養(yǎng)誘導間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化、小鼠CCl4誘導肝纖維化模型驗證了Acta2-KI所插入熒光片段的可示蹤性，證實了Cdh5-CreERT/Acta2-KI遺傳示蹤小鼠的有效性、可靠性。進一步闡明了肝纖維化過程中肌纖維母細胞的來源多樣性，這將為慢性肝損傷的病理機制研究和抗纖維化治療提供新的理論依據(jù)。

倫理學聲明：動物實驗操作符合空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院倫理委員會標準，倫理審批時間:2018年3月6日，批號：KY20183238-1。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：許皓、阮柏完成實驗設計，分析數(shù)據(jù)，撰寫文章；歷志文、房志強協(xié)助實驗操作和數(shù)據(jù)收集分析；王琳、竇科峰指導研究思路，修改文章并定稿。