高 萌，張冬野，馮國軍，楊曉旭，劉 暢，閆志山，劉大軍

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

硒(Se)是一種對(duì)植物生長發(fā)育有益的微量元素[1-2]，是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的組成成分和活性中心，含硒的GSH-Px可以催化過氧化物分解，清除植株體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞和細(xì)胞膜免受氧化損傷[3-4]。眾多研究表明，硒參與調(diào)控植物呼吸作用和光合作用，可提高植物抗逆性，抵御植物體內(nèi)自由基的傷害，緩解植物體內(nèi)重金屬的毒害[5-6]。郁飛燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)水稻幼苗施加一定濃度的硒，可以緩解鎘脅迫對(duì)水稻幼苗生物量的抑制作用，并顯著提高葉綠素含量。微量元素硒不僅是植物生長所需的一種有益元素，也是生物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)。人體攝入富含硒元素的食物有清除自由基、抗衰老、防癌等作用[8]。當(dāng)人體缺少硒元素的時(shí)候會(huì)引發(fā)克山病、脫發(fā)等生理疾病[9]。

輻射誘變育種是一種較為簡(jiǎn)單、能夠穩(wěn)定變異且具有高繁殖效率等優(yōu)勢(shì)的育種手段[10]，較傳統(tǒng)育種高效、快速，較轉(zhuǎn)基因育種更為經(jīng)濟(jì)，是產(chǎn)生新品種的主要手段之一。已有研究表明，菜豆[11]、唐菖蒲[12]、月季[13]、菊花[14]等植物已通過輻射誘變手段進(jìn)行育種。Nagatomi等[15]在輻射和體外培養(yǎng)對(duì)菊花花色突變的研究中發(fā)現(xiàn)，6種菊花的花色突變品種來源于長期輻射。余蓉培等[16]使用60Co-γ射線對(duì)波士頓蕨的綠色球狀體進(jìn)行輻照，篩選得到了葉片變異性狀顯著的突變體Neg1。李樹發(fā)等[17]使用60Co-γ射線輻射選育出了1個(gè)切花月季變異新品種。聶碩等[18]使用60Co-γ射線對(duì)紫薇種子輻射后，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)對(duì)白粉病免疫和1個(gè)對(duì)白粉病高抗的品種，但尚未明確其生理指標(biāo)的變化。但是，植株在輻照后易產(chǎn)生損傷。前人研究中發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻射會(huì)對(duì)植物部分生理生化指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響，但菜豆這些方面的研究還鮮見報(bào)道。

菜豆(Phaseolus vulgaris)是一種重要的蔬菜作物，也是國內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，具有營養(yǎng)豐富、口感鮮美、外觀亮麗的特點(diǎn)。而60Co-γ輻射誘變育種可以提高變異頻率，能夠在較短時(shí)間內(nèi)培育出菜豆新品種。但60Co-γ射線處理易導(dǎo)致植物生理和遺傳損傷，嚴(yán)重降低其成活率。本研究在緩解60Co-γ輻射對(duì)菜豆的影響、減輕菜豆的輻射負(fù)面損傷和提高誘變效果方面具有重要的意義，也可為加速菜豆新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

目前關(guān)于外源Se對(duì)菜豆的影響鮮有報(bào)道，Se對(duì)60Co-γ輻射下菜豆生長的影響機(jī)理尚不清楚。本研究以菜豆品種‘13-6-1-2’和‘紫冠’為試驗(yàn)材料，分析外源Se處理對(duì)60Co-γ輻射下2個(gè)菜豆品種的表型、抗氧化酶活性、丙二醛、葉綠素以及硒含量的變化情況，初步探索外源Se對(duì)菜豆60Co-γ輻射的緩解能力，闡述外源硒對(duì)于60Co-γ輻射下菜豆幼苗生長和生理影響，旨在為菜豆的輻射誘變育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究田間試驗(yàn)于2021年3—6月在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)園藝試驗(yàn)基地進(jìn)行，該地屬于典型的溫帶季風(fēng)氣候，冬季寒冷干燥，夏季炎熱多雨，年平均氣溫4.2℃，試驗(yàn)期間為當(dāng)?shù)卣l件。室內(nèi)試驗(yàn)在黑龍江大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

供試菜豆品種為‘13-6-1-2’和‘紫冠’（黑龍江大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝團(tuán)隊(duì)培育），種植于黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)園藝試驗(yàn)基地。供試試劑為亞硒酸鈉（阿法埃莎有限公司生產(chǎn)）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在2個(gè)菜豆品種幼苗兩葉一心時(shí)期，采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)將2個(gè)品種均分為4組，選晴朗無風(fēng)的16:00各選取2組噴施硒溶液，葉面噴施亞硒酸鈉溶液的濃度為0、50 μg/mL，噴灑時(shí)以每片葉的正反都均勻附著溶液、0.5 h內(nèi)未干為標(biāo)準(zhǔn)。生育期內(nèi)進(jìn)行正常管理。噴灑后第2～3天進(jìn)行60Co-γ輻照處理，輻照劑量為0、120 Gy（半致死劑量），處理后當(dāng)天選取2～5 g的初生真葉測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。具體處理包括CK1空白對(duì)照(Na2SeO30μg/mL，0Gy)、CK2僅噴硒(Na2SeO350μg/mL，0 Gy)、CK3僅射線(Na2SeO30 μg/mL，120 Gy)、T1噴硒后射線處理(Na2SeO350 μg/mL，120 Gy)。每個(gè)處理設(shè)置60株菜豆幼苗，進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4 項(xiàng)目測(cè)定

1.4.1 性狀觀察 于輻照處理后和采樣前進(jìn)行表型觀察，包括長勢(shì)、葉片生長狀況等，分析2個(gè)品種在不同處理后的生長差異。

1.4.2 抗氧化酶活性、丙二醛含量的測(cè)定 性狀觀察后，采用可見分光光度法、紫外分光光度法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性和丙二醛(MDA)的含量[20]。

1.4.3 葉綠素含量測(cè)定 抗氧化酶活性、丙二醛含量測(cè)定后，采用ELISA法（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）48T進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司MM-36073O2植物葉綠素(Chlorophyll)ELISA試劑盒）。

1.4.4 硒含量測(cè)定 取處理完成后的噴施外源硒幼苗初生真葉與未噴施外源硒幼苗初生真葉各200 g左右，采用熒光分光光度法進(jìn)行菜豆幼苗硒含量的測(cè)定[21]。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析 所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 20.0軟件處理，采用Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)(P＜0.05)。利用Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗的表型影響

葉面外源噴施亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻射下的菜豆幼苗表型有一定的影響（圖1）。2個(gè)菜豆品種的CK1處理，作為空白對(duì)照，表現(xiàn)為正常生長；CK2處理（僅外源Se）長勢(shì)較好，與CK1相比生長有所促進(jìn)。而2個(gè)菜豆品種的CK3處理（僅60Co-γ射線）則表現(xiàn)為明顯的葉片萎蔫；T1（外源Se+60Co-γ射線）處理的葉片萎蔫程度較輕，較CK3有所緩解。

圖1 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗的表形影響

2.2 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗抗氧化酶的影響

通過分析可以看出，施用外源亞硒酸鈉可以調(diào)節(jié)60Co-γ輻射下菜豆幼苗的MDA含量和SOD、POD以及CAT的活性。

2.2.1 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片SOD活性的影響 超氧化物歧化酶(SOD)的作用原理是先催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，然后清除過多超氧離子自由基[22]。由圖2可看到，僅外源Se處理(CK2)時(shí)，‘13-6-1-2’的SOD活性有顯著提高，經(jīng)方差分析，其對(duì)植株SOD活性促進(jìn)作用較射線處理(CK3)時(shí)更明顯，活性為95.238 U/g；而‘紫冠’的SOD活性有不顯著下降。射線處理(CK3)時(shí)，‘13-6-1-2’品種的SOD活性有所提高；‘紫冠’的SOD活性顯著提高到103.088U/g。當(dāng)植株外源Se處理后再進(jìn)行射線照射(T1)時(shí)，‘13-6-1-2’葉片內(nèi)的SOD活性達(dá)到了117.71 U/g，較空白對(duì)照組CK1增高74.468 U/g，提高了172.212%；而‘紫冠’提高到了145.191 U/g，較空白對(duì)照組CK1增加了69.692 U/g。說明噴硒可以解除60Co-γ輻照對(duì)菜豆幼苗組織細(xì)胞的損傷并顯著促進(jìn)其植株體內(nèi)酶活性升高。

圖2 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片SOD活性的影響

2.2.2 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片POD活性的影響 由圖3可以看出，CK2對(duì)‘13-6-1-2’幼苗POD活性產(chǎn)生了顯著促進(jìn)作用，達(dá)到了10043.264 U/g，較空白對(duì)照組CK1提高了83.572%；而對(duì)‘紫冠’幼苗產(chǎn)生顯著抑制作用，降低了4519.944 U/g，較空白對(duì)照組CK1的抑制率為45.752%。2個(gè)品種CK3中的菜豆幼苗POD活性與空白對(duì)照組CK1無顯著差異。但T1中，‘13-6-1-2’幼苗的POD活性較空白對(duì)照組CK1顯著提升了4217.981 U/g，與僅富硒處理的10043.264 U/g相對(duì)比，促進(jìn)程度相近；而‘紫冠’幼苗的POD活性經(jīng)方差分析較空白對(duì)照組CK1無顯著變化，雖較僅射線處理組100594.883 U/g有減少趨勢(shì)，但較僅富硒處理組5359.261 U/g有十分顯著的促進(jìn)作用，較僅富硒處理組增加了72.538%。說明施用外源硒對(duì)不同品種菜豆幼苗POD活性產(chǎn)生不同影響，既可產(chǎn)生促進(jìn)作用也可產(chǎn)生抑制作用；60Co-γ輻照處理對(duì)菜豆幼苗POD活性無顯著影響，但是可以解除硒對(duì)菜豆幼苗POD活性的抑制作用。

圖3 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片POD活性的影響

2.2.3 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片CAT活性的影響 由圖4可以看出，CK2會(huì)不同程度抑制2個(gè)品種菜豆幼苗的CAT活性，‘紫冠’降低到341.034 U/g，較空白對(duì)照組CK1變化不大；‘13-6-1-2’的抑制效果更顯著，為426.462 U/g，較空白對(duì)照組CK1 CAT活性降低了341.486 U/g。CK3中輻射對(duì)‘13-6-1-2’無顯著影響，但明顯促進(jìn)了‘紫冠’幼苗的CAT活性，為526.128 U/g，較空白對(duì)照組CK1增加了38.489%。T1中，2個(gè)品種的CAT活性均達(dá)到了最高值，‘紫冠’為681.39 U/g，‘13-6-1-2’達(dá)到949.878 U/g，分別較空白對(duì)照組CK1增加了79.332%和23.69%。說明富硒處理會(huì)不同程度抑制菜豆幼苗的CAT活性，但外源亞硒酸鈉處理后的60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片CAT活性均會(huì)增加，提高菜豆幼苗的抗氧化能力。

2.2.4 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片MDA活性的影響 由圖5可以看出，CK2可以不同程度促進(jìn)菜豆幼苗的MDA活性，其中對(duì)‘13-6-1-2’幼苗的促進(jìn)作用更顯著，達(dá)到了44.668 U/g，較空白對(duì)照組CK1增加了5.83 U/g。僅60Co-γ輻照處理(CK3)的2個(gè)品種菜豆幼苗均出現(xiàn)了不同程度的MDA活性抑制，對(duì)‘紫冠’品種的抑制作用最顯著，減少到了33.291 U/g，較空白對(duì)照組CK1降低了10.681 U/g。T1 2種菜豆葉片MDA活性均較空白對(duì)照組CK1出現(xiàn)顯著降低，‘13-6-1-2’和‘紫冠’分別降低了12.926 U/g 和18.576 U/g，較空白對(duì)照組CK1減少33.282%和43.237%。說明使用外源亞硒酸鈉可以增加菜豆幼苗的MDA活性，并顯著降低60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片的MDA活性。

圖5 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片MDA活性的影響

2.3 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉綠素含量的影響

如表1所示，CK2中2個(gè)菜豆品種的幼苗葉綠素含量均升高。CK3使2個(gè)菜豆品種的幼苗葉綠素含量不同程度的升高，其中，‘紫冠’的葉綠素含量增加最為顯著，達(dá)到了5090.772 μg/g，較空白對(duì)照組CK1增加了1219.171 μg/g。2個(gè)品種菜豆幼苗T1中的葉綠素含量較空白對(duì)照組CK1均呈現(xiàn)極顯著升高，‘13-6-1-2’、‘紫冠’分別增加了2608.632、2037.71 μg/g，較空白對(duì)照組CK1提高70.151%、52.632%。表明使用外源Se處理60Co-γ輻照菜豆幼苗，幼苗的葉綠素含量有極顯著增長，其中對(duì)‘13-6-1-2’的增長作用更為顯著。

表1 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片葉綠素含量的影響 μg/g

2.4 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗硒含量的影響

如表2所示，‘13-6-1-2’和‘紫冠’菜豆幼苗不噴施外源Se時(shí)均為0.042 mg/kg。當(dāng)2個(gè)品種幼苗都噴施50 μg/mL的外源Se后，植株體內(nèi)硒含量分別為11.5、11.4 mg/kg，較不噴硒組增加了27280.952%、27042.857%。表明噴施外源硒后菜豆幼苗硒含量劇增，即葉面噴施外源硒補(bǔ)給方式對(duì)菜豆植株體內(nèi)硒的富集有十分顯著的效果。

表2 外源亞硒酸鈉對(duì)60Co-γ輻照菜豆幼苗的含硒量 mg/kg

3 結(jié)論與討論

輻射誘變育種是一種較為簡(jiǎn)單、能夠穩(wěn)定變異且具有高繁殖效率等優(yōu)勢(shì)的育種手段，較傳統(tǒng)育種高效、快速，較轉(zhuǎn)基因育種更為經(jīng)濟(jì)，是產(chǎn)生新品種的主要手段之一。但是，植株在輻照后易產(chǎn)生損傷。前人研究發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻射能夠?qū)χ参锊糠稚砩笜?biāo)產(chǎn)生顯著影響，主要包括植物幼苗體內(nèi)葉綠素含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、丙二醛(MDA)含量等生理生化指標(biāo)[24]。而過高劑量的輻射會(huì)抑制菜豆的生長發(fā)育，并對(duì)生理指標(biāo)產(chǎn)生影響[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源Se可以緩解60Co-γ輻照對(duì)幼苗生理指標(biāo)的影響。

在植物細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)中，SOD可以消除超氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷，POD可以通過降解植物體細(xì)胞中的H2O2來避免對(duì)細(xì)胞的損傷，CAT可以通過促進(jìn)H2O2的分解來減少H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷[25-26]。在本試驗(yàn)中，對(duì)使用外源Se處理60Co-γ輻照菜豆幼苗葉片的POD、SOD、CAT抗氧化酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)菜豆幼苗的POD、SOD、CAT抗氧化酶活性均較對(duì)照組(CK1)有不同程度的提升。在CK2處理時(shí)，‘13-6-1-2’的POD、SOD抗氧化酶活性被促進(jìn)，‘13-6-1-2’的CAT與‘紫冠’的POD、SOD、CAT抗氧化酶活性均被抑制，這可能是因?yàn)橥庠碨e可以對(duì)菜豆幼苗酶活性產(chǎn)生促進(jìn)或抑制2種作用。當(dāng)菜豆幼苗在CK3中，植株體內(nèi)POD、SOD、CAT抗氧化酶活性均有不同程度的提升，可能是由于植株對(duì)自身的保護(hù)作用，這種自我保護(hù)現(xiàn)象能夠減輕輻射帶來的脅迫，使植株正常生長，并在其他方面對(duì)植株生長起到促進(jìn)作用；只有‘13-6-1-2’的CAT抗氧化酶活性出現(xiàn)了顯著降低，這可能是由于葉片細(xì)胞內(nèi)的超氧自由基大量積累，使細(xì)胞的膜透性受到了一定的損傷，影響植物的保護(hù)酶系統(tǒng)，從而對(duì)菜豆幼苗的生長產(chǎn)生抑制。但對(duì)于T1中的菜豆幼苗葉片，各生理指標(biāo)均不同程度上升，只有‘紫冠’的POD抗氧化酶活性出現(xiàn)了不顯著降低，可能是由于硒可以解除60Co-γ輻照或自身對(duì)植株產(chǎn)生的抑制作用而促進(jìn)酶活性上升超過空白對(duì)照組CK1，但當(dāng)抑制作用過大時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)解除作用不足導(dǎo)致酶活性上升程度不及空白對(duì)照組CK1。這與前人的研究結(jié)果一致。

MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。本研究中，‘13-6-1-2’和‘紫冠’的MDA抗氧化酶活性變化趨勢(shì)一致，T1中的菜豆幼苗MDA抗氧化酶的活性顯著降低，CK2中的酶活性增加，表明硒可以促進(jìn)幼苗體內(nèi)丙二醛含量，加速菜豆葉片膜脂過氧化反應(yīng)的發(fā)生。CK3中‘13-6-1-2’的MDA抗氧化酶活性不顯著增高，是射線導(dǎo)致植株受到的細(xì)胞損傷程度大于自身保護(hù)能力，使得植株受到了一定損傷；‘紫冠’的MDA抗氧化酶活性降低，由于射線對(duì)植株的損傷引起了植株細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。而T1組的酶活性顯著降低，可能是硒緩解了60Co-γ輻照對(duì)幼苗的影響，并能顯著降低植株受到的細(xì)胞損傷程度，說明硒對(duì)使用外源Se處理60Co-γ輻照菜豆幼苗細(xì)胞膜有一定的保護(hù)作用。

葉綠素含量是直接反映逆境造成的植物所受損害程度的生理指標(biāo)之一[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，3種處理方式中菜豆幼苗葉片內(nèi)的葉綠素含量均升高，特別是T1中的2個(gè)品種菜豆幼苗葉片葉綠素含量均達(dá)到了最大值。推測(cè)一定量的硒和60Co-γ輻照有助于菜豆幼苗葉片通過增加葉綠素的含量來提高自身的光合效率，有利于葉片進(jìn)行光合作用，對(duì)植株的生長起到一定的促進(jìn)作用。這與前人關(guān)于富硒栽培油菜、紫薇[28-29]等植物的研究結(jié)果類似。

本試驗(yàn)結(jié)合前人研究結(jié)果及‘13-6-1-2’和‘紫冠’菜豆幼苗的情況，選擇輻射劑量為半致死劑量120 Gy的60Co-γ射線，對(duì)2個(gè)品種的菜豆幼苗葉片進(jìn)行外源噴施亞硒酸鈉溶液和輻射處理，發(fā)現(xiàn)外源葉面噴硒可以有效增加菜豆幼苗體內(nèi)的硒含量，并且硒可以顯著緩解60Co-γ射線對(duì)菜豆幼苗的影響，增強(qiáng)菜豆幼苗抗輻射能力，提高植株生理指標(biāo)、形態(tài)指標(biāo)，對(duì)植株的生長發(fā)育起到一定的促進(jìn)作用，但促進(jìn)作用的效果與菜豆品種有關(guān)。