陳永，陳艷娟，劉冬舟

1 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市人民醫(yī)院） 廣州廣東 518000

2 暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣州廣東 510632

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為病理機制的自身免疫病，其突出病理特點是滑膜增生并侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞畸形[1]。在發(fā)達國家RA患病率為0.5%～1%，中國大陸地區(qū)發(fā)病率為0.42%。每年新發(fā)病RA人數(shù)為每5～50人/10萬人[2]。在RA患者人群中有一組特殊的人群，即老年RA患者。老年的RA患者包括60歲以后發(fā)病的患者和年輕時候發(fā)病但是超過60歲的老年人群[3]。由于人口的老齡化以及老年發(fā)病率增加，老年的RA患病人群在逐年升高[4]。相對于年輕發(fā)病的RA患者，老年發(fā)病的RA患者具有發(fā)病急、常伴系統(tǒng)損害、功能預(yù)后差等特點[5]。另外由于合并癥增多，老年RA患者常需要多種藥物治療各種合并癥，這使得復(fù)雜的RA治療方案難以優(yōu)化，并且由于肝和腎功能不全而增加藥物相互作用、不良事件和禁忌癥的可能性[6]。因此常規(guī)的RA達標(biāo)治療對于老年患者藥物副作用風(fēng)險面臨挑戰(zhàn)。臨床對老年RA的治療常常未能達標(biāo)[7-8]。

中醫(yī)藥控制RA的相關(guān)研究也非常豐富。但是在臨床實踐中，單純以中藥控制RA常難以達到讓患者滿意的效果。但中醫(yī)藥是基于整體觀，在對患者整個機體康復(fù)中凸顯特色[9-10]，尤其是在與西藥聯(lián)用時，起到減毒增效的作用。顯然中藥在中西醫(yī)結(jié)合治療老年性RA患者有一定的優(yōu)勢。前期在研究白塞病的治療方劑中，發(fā)現(xiàn)出自《傷寒雜病論》的甘草瀉心湯可用于消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、婦科等疾病[11-12]。體現(xiàn)異病同治的效應(yīng)。在臨床實踐中，為了降低毒性、使藥性更加溫和，作者結(jié)合中醫(yī)藥理論知識及國內(nèi)外文獻研究結(jié)果，對甘草瀉心湯進行了改良，使其更適合老年性RA，并將改良后的藥方命名為甘草養(yǎng)陰湯（Gancao Nurish-Yin decoction，GCNY）。改良后的配方成分包括：甘草、人參、干姜、蒲公英、羅漢果、玉竹、大棗等7種中藥成分（專利申請?zhí)枺?01910843519.9）通過研究顯示對RA有效。本研究擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘GCNY作用于老年RA的靶點并研究其作用的信號通路，為進一步實驗研究提供一定的理論依據(jù)。

研究方法

1 藥物有效成分及作用靶點獲取

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[13]中檢索窗口依次輸入中藥名稱：甘草、人參、大棗、玉竹、羅漢果、干姜，搜索的得到對應(yīng)的有效化學(xué)成分（Mol ID），設(shè)置篩選條件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥物特性（Drug-like properties，DL）≥0.18。然后在該平臺檢索各種化學(xué)成分作用的靶點蛋白。利用疾病靶點標(biāo)準(zhǔn)化Uniprot數(shù)據(jù)庫[14]，分別檢索上述得到藥物潛在靶點蛋白名稱，種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，獲取其靶點的標(biāo)準(zhǔn)基因名。其中，TCMSP數(shù)據(jù)庫未檢索到蒲公英的有效作用成分，遂通過中藥綜合資源數(shù)據(jù)庫（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）[15]共查得蒲公英的基因靶點25個。

2 GCNY藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將GCNY7種中藥對應(yīng)的有效成分與作用靶點基因?qū)隒ytoscape 3.7.1 軟件中，利用軟件功能構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)作用圖，在網(wǎng)絡(luò)圖中單味中藥種類、有效活性成分和靶點基因用不同形狀或者顏色的節(jié)點表示。

3 疾病相關(guān)基因的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索與“衰老（Aging）”及“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）”相關(guān)的靶點基因，分別獲得26060個、4465個，將這些疾病靶點基因輸入計算機R語言中，剔除重復(fù)基因名稱，選擇相關(guān)相關(guān)系數(shù)（“Relevance.score”）大于10的相關(guān)基因，最終獲得216個衰老相關(guān)的基因和393個RA相關(guān)基因。

4 GCNY作用于衰老的靶點及信號通路分析

為了進一步探究GCNY與衰老及RA的相互作用關(guān)系，在計算機R語言中使VennDiagram包將GCNY靶點基因和衰老或RA相關(guān)基因作交集，即獲得衰老與RA或者三者的共同靶點基因，并繪制韋恩圖。并對獲得的交集基因使用R軟件中ClusterProfile包中的enrichGO函數(shù)對差異基因進行GO功能富集分析和enrich KEGG函數(shù)進行信號通路富集分析[17]。

5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述的得到GCNY作用于衰老和RA的交集基因上傳至STRING數(shù)據(jù)平臺[18]，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設(shè)為“Home sapiens”，建立藥物靶蛋白-疾病靶蛋白（PPI）相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建采用默認參數(shù)，下載PPI網(wǎng)絡(luò)圖的數(shù)據(jù)矩陣，并將其輸入Cytoscape 3.7.1 軟件，繪制GCNY作用于衰老和RA交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

結(jié) 果

1 GCNY的作用靶點挖掘

GCNY除蒲公英以外共含有有效成分130個，包括蒲公英整個配方成分共涉及靶點277個。將基因靶點上傳至 Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。其中，甘草有效作用成分包括Inermine、Mairin、甘草酚、Jaranol、苜蓿素等88個；作用靶點基因20個，如PIK3、PGR、KDR、NOS2、HTR2A等。大棗有效成分28個如千金藤堿、香豆素、豆甾醇等；作用靶點基因202個，如DRD1、HSP90、CYP3A4、AR、PDE10A等。人參有效作用成分17個，如β-谷甾醇、山奈酚、人參皂苷rh2等；作用基因靶 點231個；如：TNF、IL1B、F10、GSTM1、PRKACA等。羅漢果有效作用成分6個，如鄰苯二甲酸2-乙基己酯、黑麥草堿等；作用靶點基因23個，如PTGS1、RXRA等。干姜有效作用成分5個，包括3，4，5，7-四羥基-8-甲氧基黃酮、谷甾醇等；作用基因靶點22個，CDK2等。玉竹有效作用成分6個，如4’，5，7-三羥基-6-甲基-8-甲氧基-高異黃酮、正香豆酰酪胺等；作用靶點基因20個，MAOB、CALM、NOS2等。在TCMSP中未檢索到蒲公英有效成分，通過TCMIP數(shù)據(jù)庫，查得蒲公英作用靶點基因25個，包括LSS、VDR、ESR1等。多種成分共可共同調(diào)節(jié)一些相同的靶點基因。如配方的7種成分均可作用于PGR、NCOA2；除蒲公英外，其余6種成分均可作用于PTGS1、SCN5A、PTGS2、HSP90AA1、PRKACA、NOS2、NR3C2、PDE3A、AR等靶點，見圖1。

圖1 GCNY藥物-成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2 RA與衰老共同基因靶點

通過數(shù)據(jù)庫共獲得到RA發(fā)病相關(guān)基因393個、衰老相關(guān)基因216個、RA合并衰老共同基因61個，包 括TP53、IGF1、MMP1、MMP9、PTGS2、NOS2、STAT3等（圖2）。主要參與的信號通路包括：糖尿病并發(fā)癥中的年齡-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、類 風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）、癌癥中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、脂質(zhì)和動脈硬化（lipid and atherosclerosis）、IL-17信號通路等通路，見圖2，圖3。

圖2 RA與衰老的共同基因靶點及KEGG富集相關(guān)通路

圖3 RA與衰老的共同基因靶點參與的前20個信號通路

3 GCNY作用與老年RA的基因靶點分析

在RA與衰老的共同參與基因中，可被GCNY作用的基因靶點共26個，包括：VEGFA、MMP9、CCL2、TNF、ALB、IL6、IL1B、MMP2、TP53、IL10、TGFB1、STAT3、CXCL8、PTGS2、NOS2、ESR1、MMP1、ICAM1、IFNG、MAPK1、IL2、COL1A1、IL1A、MPO、CRP、CAT等（圖4A，B）。

圖4 GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點

GCNY潛在作用于RA、衰老及RA合并衰老的共同基因靶點；（B）GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點的蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

通過GO富集通路分析，GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點作用于生物學(xué)過程的通路包括對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）、對 細 菌 來 源 的 分 子 的 反 應(yīng)（resopnse to molecule of bacterial origin）、對 脂 多 糖 的 反 應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、活性氧代謝過程的調(diào) 節(jié)（regulation of reactive oxygen species metabolic process）；作用于細胞成分的載體腔（veicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、血小板α顆粒腔（platelet alpha granule lumen）；分子功能方面包括：四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、受體配體活性（receptor ligand activity）、過氧化物酶活性（peroxidase activity），見圖5。

圖5 GCNY潛在作用于RA合并衰老的共同基因靶點的GO通路富集分析

討 論

RA是最常見的全身性和慢性自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AID）之一。 除了骨和關(guān)節(jié)軟骨是最易受損害外，其他器官也可能受累并導(dǎo)致多種表現(xiàn)，如貧血、骨質(zhì)疏松、感染、皮膚或肺損傷[19]。隨著慢性炎癥被證明是導(dǎo)致衰老和年齡相關(guān)疾病發(fā)病的機制之一，炎癥相關(guān)性衰老引起重視[20]。來自臨床觀察的證據(jù)表明患有AID的患者，如RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 、強直性脊柱病、白塞氏病都表現(xiàn)出對老年相關(guān)疾病（age-related disease，ARDs） 的易感性，尤其是心血管疾病 、糖尿病等[21-22]。對于這一現(xiàn)象的解釋是炎癥性衰老（inflammation），即炎癥及炎癥影響了代謝相關(guān)生物學(xué)過程，進而調(diào)控衰老進展[23]。在本研究中，TP53、IGF1、MMP1、MMP9、PTGS2、NOS2、STAT3等61個基因靶點參與RA發(fā)病的基因，也被發(fā)現(xiàn)是同時參與衰老的相關(guān)基因。

在抑制炎癥方面，GCNY配方相關(guān)的7種植物成分及其單體成分研究比較豐富。如研究顯示：甘草查耳酮（Licochalcone A、B、和D）顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄激活，Licochalcone B和D顯著降低LPS誘導(dǎo)的NO，TNF-α和MCP-1的產(chǎn)生[24]；從甘草根中提取的一種天然黃酮類脂蛋白Liquiritin，能顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的RA-FLS的增殖、促進核DNA片段化、并改變線粒體膜電位以加速細胞凋亡、Liquiritin通過下調(diào)Bcl-2/Bax的比例，并抑制VEGF的表達以及JNK和P38的磷酸化，顯示改善了RA炎癥浸潤和血管生成的臨床評分、并在體內(nèi)誘導(dǎo)了滑膜組織的細胞凋亡[25]。大量研究證明了人參和人參皂甙的抗炎特性，它們對RA發(fā)病機理的改善作用。如化合物K（compound K，CK）通過抑制Janus激酶（JAK）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號傳導(dǎo)途徑，顯著降低了RA成纖維樣滑膜細胞MMP-1和MMP-3的產(chǎn)生；人參皂甙Rb1（G-Rb1）顯著抑制了干擾素-γ誘導(dǎo)的人RA患者外周血單個核細胞、軟骨細胞和成纖維樣滑膜細胞中TNF-α的表達[26]。從中草藥蒲公英中分離出來的一種生物活性五環(huán)三萜類化合物之一的蒲公英醇（taraxasterol，TAR）顯著抑制CIA小鼠中IL-1β誘導(dǎo)的促炎性細胞因子表達，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-8、以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的產(chǎn)生[27]。同樣，在體內(nèi)和體外實驗中大量研究證實GCNY配伍中的其它植物成分，如羅漢果、玉竹、大棗和干姜所含有的成分同時具有抑制炎癥反應(yīng)的作用和抗衰老的作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)挖掘，GCNY作用于RA和衰老的共同靶點基因26個，其中細胞因子通路、細胞因子受體、趨化因子受體和抗氧化通路等是重要的靶基因富集通路。當(dāng)然GCNY的功效和潛在機理是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不能完全詮釋的。如GCNY中，甘草益氣補中，清熱解毒為君藥；人參補氣、生津，玉竹養(yǎng)陰潤燥，協(xié)調(diào)甘草作用，并消除其水鈉潴留的副作用，為臣藥。蒲公英、羅漢果清熱解毒，干姜溫中散寒，回陽通脈，屬于佐藥；大棗養(yǎng)血安神、緩和藥性為使藥。整個配方陰陽調(diào)和、滋陰為主，陰中求陽；對機體的陰陽失調(diào)形成了“緩沖液”一樣的作用。而這些是無法通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進行論證的。中西醫(yī)結(jié)合治療老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是體現(xiàn)中醫(yī)優(yōu)勢、提高患者療效的可靠途徑，我們將進一步通過基礎(chǔ)及臨床研究對GCNY作用機制及療效評價進行研究開發(fā)。