■李淑瑤 李永安 李佑杰 張 江 熊六鳳 王自蕊*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.南昌市特色水生生物營養(yǎng)生理與健康養(yǎng)殖重點實驗室，江西南昌 330045；3.安杰利（重慶）生物科技有限公司，重慶 402460）

目前，關(guān)于動物源抗菌肽的應(yīng)用較多，而微生物源抗菌肽在魚類飼料中的應(yīng)用報道較少。桿菌七肽（又名腺苷七肽、Microcin C7七肽）是眾多抗菌肽種類中的一種，是腸道微生物分泌的一類細(xì)菌素抗菌肽，最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，其分子量較小，由7個氨基酸殘基組成，其抗菌機(jī)制是通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和干擾微生物蛋白翻譯過程而實現(xiàn)[1-2]，且具有抵抗酶降解以及耐高溫的特點，其生產(chǎn)方式可以是微生物發(fā)酵或者是化學(xué)合成[3]。與其他來源的抗菌肽相比，微生物源抗菌肽還具有原料易獲取、生產(chǎn)周期短、易于規(guī)模化生產(chǎn)等突出優(yōu)勢[4]。體外試驗表明，桿菌七肽的抗菌抗逆性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可進(jìn)行制粒和膨化等工藝，質(zhì)量可控，有效成分含量高，安全性較高，相比其他一些抗菌肽由于對動物細(xì)胞存在溶血性而無法臨床應(yīng)用而言，桿菌七肽并不存在此問題[5-7]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)飼料中添加抗菌肽能夠促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和機(jī)體免疫力[8-9]。如今，抗生素耐藥性已成為全世界廣泛關(guān)注的一個問題，嚴(yán)重威脅著人類以及動物健康，因此迫切地需要新的解決策略和新的抗生素，而桿菌七肽就是一種很有希望解決抗生素耐藥性問題的抗生素替代物。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）屬鯉形目、鯉科、草魚屬，為中國淡水魚中“四大家魚”之一[10]，因其具有生長快、個體大、肉味鮮美等優(yōu)點，歷來受到廣大消費者的青睞。在集約化養(yǎng)殖過程中，為了促進(jìn)草魚生長和降低細(xì)菌性疾病的發(fā)生，養(yǎng)殖者往往在飼料中添加抗生素，但長期這樣下去，養(yǎng)殖風(fēng)險增大，草魚會產(chǎn)生耐藥性，魚肉產(chǎn)品中的抗生素殘留量也會增加，影響消費者的身體健康[11]。目前關(guān)于桿菌七肽的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控、殺菌活性以及殺菌機(jī)制等方面，其作為飼料添加劑用于水產(chǎn)動物生長性能的研究幾乎沒有，因此本試驗將不同水平的桿菌七肽添加在草魚飼料中，研究其對草魚生長性能、血清生化指標(biāo)和腸道健康的影響，從而更好地為桿菌七肽在草魚飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與試驗飼料

試驗共分5個處理，每個處理5個重復(fù)，每個網(wǎng)箱有魚25尾，均重（14.90±0.15）g。以魚粉、豆粕、菜粕、小麥粉等常規(guī)飼料原料成分組成基礎(chǔ)飼料，根據(jù)《草魚配合飼料》（GB/T 36205—2018）要求的營養(yǎng)水平設(shè)計飼料配方。試驗分為5個處理組，分別在基礎(chǔ)飼料中添加桿菌七肽為0（對照組）、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/kg（桿菌七肽產(chǎn)品中桿菌七肽的含量為1%，載體為玉米芯粉和麥飯石，占比80%～89%，二氧化硅10%～15%，桿菌七肽含量的測定方法采用高效液相色譜法[12]，該產(chǎn)品由某生物科技有限公司提供）。將飼料原料經(jīng)粉碎過60目篩，混合均勻后加工成2 mm顆粒，晾干后貯備飼喂?；A(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地進(jìn)行。草魚運到時用2%的食鹽水消毒，并進(jìn)行水溫過渡。暫養(yǎng)期間用基礎(chǔ)飼料投喂2周。試驗開始前禁食24 h，選用規(guī)格整齊、體格健壯、體重相近的魚隨機(jī)分到25個網(wǎng)箱。每天08：00、17：00各投喂飼料1次，每次投喂均做到細(xì)撒、慢投，投喂時間不少于30 min。日投餌量一般根據(jù)試驗魚總重量與投飼率的乘積所決定，也受天氣變化、試驗魚食欲強(qiáng)弱的影響，酌情增減日投飼量，日投喂率約為體重的10%，對未吃食完的飼料進(jìn)行打撈并稱重，及時捕撈死亡魚體，以免污染水質(zhì)。日夜連續(xù)充氣增氧、控溫，以保持溶氧量在5 mg/L以上，水溫控制在25 ℃左右。飼養(yǎng)周期為60 d。

1.3 樣品采集及測定方法

試驗結(jié)束后禁食24 h，稱重，計算末體重、增重率及特定生長率；抽血后立即解剖，稱量內(nèi)臟重和胴體重，分離腎臟、脾臟、肝臟和腸道并稱重；測量體長、全長及腸長并做好記錄；取腸道（前、中、后）做切片；取腸道內(nèi)容物用于微生物的培養(yǎng)分析：解剖取出腸道，擠出內(nèi)容物至無菌離心管中，立即放入液氮，之后放于-80 ℃冰箱凍存；取背肌用于肌肉營養(yǎng)水平的測定，-20 ℃保存。

1.4 生長性能指標(biāo)

增重率（WGR，%）=（終末體重-初始體重）/初始體重×100

特定生長率（SGR，%/d）= [Ln（終末體重）-Ln（初始體重）]/試驗天數(shù)×100

攝食率（FI，%/d）=投喂飼料總量/[（初始體重+終末體重）/2×試驗天數(shù)]×100

飼料系數(shù)（FCR）=平均飼料攝入量/（終末體重-初始體重）肥滿度（CF，g/cm3）=體重/體長3×100胴體率（CR，%）=胴體重/體重×100

1.5 形體指數(shù)

內(nèi)臟指數(shù)（VSI，%）=內(nèi)臟重/體重×100

腎臟指數(shù)（RI，%）=腎臟重/體重×100

肝臟指數(shù)（HSI，%）=肝臟重/體重×100

脾臟指數(shù)（SI，%）=脾臟重/體重×100

腸道相對質(zhì)量（%）=腸道重量/體重×100

腸道相對長度（%）=腸道長度/體重×100。

腸系膜脂肪比（MFI，%）=腸系膜脂肪重/體重×100

1.6 肌肉營養(yǎng)水平分析

肌肉樣品經(jīng)過干燥處理后進(jìn)行水分、粗蛋白、粗脂肪以及粗灰分含量的測定。水分含量測定采用105 ℃烘箱干燥恒重法（GB/T 6435—2014）；粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法（GB/T 6432—1994)；粗脂肪含量測定采用乙醚抽提法（GB/T 6433—2006）；粗灰分含量測定采用馬弗爐550 ℃灼燒法（GB/T 6438—2007）。

1.7 血清生化指標(biāo)測定

試驗共測定血清中6 個指標(biāo)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、三酰甘油（TG）。所有指標(biāo)均采用試劑盒測定，所用試劑盒購自南京建成生物研究所，一切操作按照說明書進(jìn)行。

1.8 腸道微生物的培養(yǎng)

解凍腸道內(nèi)容物，置于搖床37 ℃復(fù)蘇。按1 g內(nèi)容物加入9 mL 無菌PBS 緩沖溶液的比例進(jìn)行稀釋，混勻，得到樣品。然后進(jìn)行梯度稀釋，分別制備10-1、10-2、10-3和10-4稀釋液。選用10-2、10-3和10-4稀釋液進(jìn)行固體培養(yǎng)基平板劃線，每個梯度做兩個重復(fù)。大腸桿菌的培養(yǎng)選用伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，乳酸桿菌的培養(yǎng)選用MRS培養(yǎng)基。將劃線好的平板置于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，選取細(xì)菌生長疏密適當(dāng)、菌落清晰的平板進(jìn)行計數(shù)，并將結(jié)果換算成每克樣品中菌落數(shù)（CFU/g）進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.9 腸道組織切片的觀察

試驗進(jìn)行至60 d，截取草魚腸道前、中、后三段腸段，用磷酸緩沖鹽溶液小心沖洗后迅速置于4%甲醛固定液中固定。按常規(guī)方法將固定好的腸段制作成石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察并選取區(qū)域拍照（倍數(shù)×100），而后使用Image pro plus 6.0進(jìn)行腸道絨毛高度、隱窩深度和肌層厚度的測量。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA，LSD），進(jìn)行Duncan’s多重比較，分析組間差異顯著性，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加桿菌七肽對草魚生長性能的影響（見表2）

表2 桿菌七肽對草魚生長性能的影響

由表2可以看出，飼料中添加7.5 mg/kg桿菌七肽組的WGR 和SGR 顯著高于對照組（P＜0.05），分別提高34.34%和18.58%，其余組間差異不顯著（P＞0.05），10.0 mg/kg桿菌七肽組的WGR和SGR有下降趨勢。各組間攝食率和飼料系數(shù)差異不顯著（P＞0.05），7.5 mg/kg桿菌七肽組飼料系數(shù)最低，相比對照組降低26.83%。各組草魚肥滿度和胴體率組間差異不顯著（P＞0.05）。飼料中添加桿菌七肽與草魚WGR和SGR的關(guān)系通過建立折線模型得出最適添加量分別為7.8 mg/kg和7.9 mg/kg，如圖1所示。

圖1 桿菌七肽對草魚增重率和特定生長率的影響

2.2 飼料中添加桿菌七肽對草魚形體指數(shù)的影響（見表3）

由表3可知，飼料中添加桿菌七肽對草魚內(nèi)臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腸道相對重量、腸道相對長度以及腸系膜脂肪比各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 桿菌七肽對草魚形體指數(shù)的影響（%）

2.3 桿菌七肽對草魚肌肉營養(yǎng)水平的影響（見表4）

表4 桿菌七肽對草魚肌肉營養(yǎng)水平的影響（濕重基礎(chǔ)，%）

由表4 可知，在0 和2.5 mg/kg 桿菌七肽組間粗蛋白和粗脂肪含量差異不顯著（P＞0.05）。相比對照組，5.0、7.5 mg/kg 和10.0 mg/kg 桿菌七肽組的草魚肌肉粗蛋白含量有不同程度的降低，分別降低8.62%、4.28%和13.58%，粗脂肪含量顯著降低（P＜0.05）。各組間水分和粗灰分均差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 桿菌七肽對草魚血清生化指標(biāo)的影響（見表5）

由表5可知，飼料中添加桿菌七肽顯著降低血清ALT 和AST 活性，7.5 mg/kg 和10.0 mg/kg 的桿菌七肽組血清AKP活性顯著高于對照組（P＜0.05）；桿菌七肽的添加提高血清T-AOC活性；桿菌七肽含量為7.5 mg/kg時，血清SOD 活性與對照組相比顯著提高7.02%（P＜0.05），與2.5 mg/kg 和5.0 mg/kg 桿菌七肽組無顯著差異（P＞0.05），高含量的桿菌七肽（10.0 mg/kg）使得SOD活性相對于對照組顯著降低2.16%；血清TG活性在組間無顯著差異（P＞0.05）。

表5 桿菌七肽對草魚血清生化指標(biāo)的影響

2.5 桿菌七肽對草魚腸道微生物的影響（見表6）

由表6可知，采用平板菌落計數(shù)法對各組草魚腸道大腸桿菌和乳酸桿菌進(jìn)行計數(shù)，7.5 mg/kg和10.0 mg/kg桿菌七肽組腸道大腸桿菌數(shù)量顯著低于對照組（P＜0.05），桿菌七肽試驗組間無顯著性差異（P＞0.05）。5.0 mg/kg和7.5 mg/kg桿菌七肽組腸道乳酸桿菌數(shù)量顯著高于其他組（P＜0.05）。

表6 桿菌七肽對草魚腸道微生物的影響（×103 CFU/g）

2.6 桿菌七肽對草魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響（見圖2、表7）

由圖2、表7可知，7.5 mg/kg桿菌七肽組前、中、后腸的絨毛形態(tài)清晰。經(jīng)過測量，7.5 mg/kg桿菌七肽組的前腸和后腸絨毛高度顯著高于其他組（P＜0.05）；10.0 mg/kg桿菌七肽組各腸段絨毛形態(tài)不完整，其前腸絨毛高度顯著低于7.5 mg/kg桿菌七肽組（P＜0.05)，但和中腸絨毛一樣高于其他組。7.5 mg/kg桿菌七肽組前腸隱窩深度顯著高于10 mg/kg桿菌七肽組，但顯著低于對照組和5.0 mg/kg桿菌七肽組（P＜0.05)，中腸隱窩深度顯著低于10.0 mg/kg桿菌七肽組（P＜0.05)，與其余3組無顯著性差異（P＞0.05）；后腸隱窩深度與對照組無顯著性差異（P＞0.05），但顯著低于其他三組（P＜0.05)。比較各腸段組織肌層厚度得出，7.5 mg/kg桿菌七肽組三個腸段肌層厚度均高于對照組相應(yīng)腸段肌層厚度。

表7 桿菌七肽對草魚腸道組織的影響

圖2 草魚腸道組織切片

3 討論

3.1 桿菌七肽對草魚生長性能和形體指數(shù)的影響

本試驗中，桿菌七肽對草魚的WGR 和SGR 有不同程度的影響，而對FCR、FI、CF、CR和形體指數(shù)無明顯影響，說明桿菌七肽能提高草魚的生長性能，而對形體指數(shù)沒有顯著性影響。利用復(fù)合抗菌肽對草魚進(jìn)行試驗發(fā)現(xiàn)，在添加量為100、200、400、800 mg/kg 和1 600 mg/kg的復(fù)合抗菌肽試驗組中，800 mg/kg組的草魚增重率、特定生長率均最高[13]。黃小紅等[14]試驗結(jié)果表明，飼料中添加500 mg/kg天蠶素抗菌肽能夠顯著提高草魚增重率和特定生長率，相比于對照組分別提高35.05%和25.72%。在鯉魚試驗中，飼料中適量地添加抗菌肽能有效促進(jìn)鯉魚生長發(fā)育，降低餌料系數(shù)，其中5 000 IU/kg的抗菌肽添加量效果最佳[15]。在其他水產(chǎn)動物研究中也發(fā)現(xiàn)，湘云鯽飼料中添加150 mg/kg的天蠶素抗菌肽能夠使其增重率和特定生長率相比于對照組顯著性提高37.4%和27.5%，但對肥滿度和形體指數(shù)無顯著影響[16]；凡納濱對蝦飼料中添加抗菌肽使得增重率和特定生長率有所提高[17]，羅非魚飼料中添加抗菌肽也能夠促進(jìn)生長，提高增重率[18]。

本試驗中，每組之間的攝食率和飼料系數(shù)均沒有顯著性差異，但增重率、特定生長率隨著桿菌七肽添加量的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且飼料系數(shù)有降低的趨勢，表明飼料中添加桿菌七肽能促進(jìn)草魚生長，但過高的添加量會抑制草魚的生長，之所以會出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是桿菌七肽抑制有害病原菌的生長、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高腸道消化酶活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化能力等，從而提高了生長性能[19]，但高劑量的桿菌七肽也可能抑制有益菌的生長而影響到腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗桿菌七肽的最佳添加量為7.5 mg/kg，與王四新等[20]試驗的抗菌肽添加量不同，這可能是抗菌肽種類和有效成分、試驗動物品種規(guī)格以及養(yǎng)殖環(huán)境不同造成。

3.2 桿菌七肽對草魚肌肉營養(yǎng)成分的影響

檢測魚體肌肉中基本營養(yǎng)成分，如水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等含量是研究魚類肌肉品質(zhì)的基礎(chǔ)。在配合飼料中添加適量抗菌肽促進(jìn)了建鯉肌肉中蛋白質(zhì)的沉積[21-22]，但本試驗中肌肉粗蛋白含量隨著桿菌七肽的添加出現(xiàn)了降低趨勢。魚肉中脂肪含量過高會影響口感，該試驗中桿菌七肽的添加降低了粗脂肪含量，說明飼料中添加桿菌七肽能夠改善草魚魚肉品質(zhì)。

3.3 桿菌七肽對草魚血清生化指標(biāo)的影響

作為重要的生理學(xué)、病理學(xué)以及毒理學(xué)指標(biāo)，血清生化指標(biāo)的測定通常用于反映魚體營養(yǎng)代謝情況和組織器官功能[23]。在魚類研究中發(fā)現(xiàn)，天蠶素抗菌肽、Surfactin抗菌肽以及水產(chǎn)動物重組抗菌肽的添加能促進(jìn)各類水產(chǎn)動物抗氧化能力和非特異性免疫性能[24]。

在氨基酸代謝過程中，ALT和AST是兩個重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，其活性可反映機(jī)體蛋白質(zhì)的合成與分解[25-26]。ALT和AST主要存在于肝臟中，通過測定血液中ALT和AST含量的高低可以判斷肝臟是否受損[27]。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼料中添加桿菌七肽能夠降低血清中ALT和AST含量，而在肉仔雞的日糧中也發(fā)現(xiàn)添加抗菌肽能夠降低ALT水平[28]，說明桿菌七肽能夠改善肝功能，有一定的保肝作用。

AKP在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，參與吞噬細(xì)胞殺菌過程，能清除體內(nèi)異物，也是機(jī)體內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶和維持機(jī)體健康所必需的酶[25]。在凡納濱對蝦和羅非魚試驗中發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能提高血清中AKP活性[29-30]。本試驗結(jié)果表明，隨著桿菌七肽含量的增加，AKP活性提高，說明桿菌七肽提高了草魚的非特異性免疫性能。

SOD是魚體抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一，它能清除自由基，使其發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生H2O2和O2，免除其對生物分子的損傷[31]。T-AOC 用于衡量機(jī)體抗氧化功能，包括酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)[32]。研究表明飼料中添加0.4%的抗菌肽使得河蟹SOD水平提高39.51%[33]；抗菌肽也能提高羅非魚[34]和鯉魚[35]血清中T-AOC和SOD活性。本試驗中添加桿菌七肽能提高草魚血清SOD 和T-AOC 活性，有利于增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

TG 在肝臟中合成，是評價肝臟是否受損的指標(biāo)之一，肝臟嚴(yán)重受損時，TG 含量合成減少，而血清中TG含量的降低表現(xiàn)得更早[36]。草魚血清中TG活性未發(fā)生顯著性變化，說明肝臟并未受損。

3.4 桿菌七肽對草魚腸道菌群的影響

腸道微生物作為魚體消化系統(tǒng)中重要的組成部分，影響著魚類的營養(yǎng)吸收、腸道免疫和腸道生理調(diào)節(jié)[37]。大腸桿菌和乳酸桿菌均為動物體腸道內(nèi)的正常菌群，但大腸桿菌有些菌株是致病菌，含量過高則會引起疾病，乳酸桿菌能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，是動物體內(nèi)的有益菌[38]。在本試驗中，添加桿菌七肽降低草魚腸道大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸桿菌數(shù)量，這與吉富羅非魚的研究結(jié)果相似[39-40]，表明桿菌七肽可有效調(diào)節(jié)草魚腸道不同菌群的數(shù)量，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，有利于腸道微生態(tài)平衡，對維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)意義重大。

3.5 桿菌七肽對草魚腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道絨毛高度、肌層厚度和隱窩深度是評價腸道健康的重要指標(biāo)，絨毛高度影響機(jī)體對養(yǎng)分的吸收能力，絨毛高度的增加可以提高絨毛表面積，從而能夠更有效地吸收營養(yǎng)物質(zhì)[41-42]；隱窩深度影響著小腸細(xì)胞的遷移分化過程，從而影響消化吸收；腸道蠕動的動力來源于平滑肌的收縮，當(dāng)肌層厚度增加時，腸道蠕動增強(qiáng)，從而提高腸道的消化吸收能力[24]。研究表明，在沙門氏菌日糧中添加AMPs 導(dǎo)致大口黑鱸幼魚絨毛高度、絨毛寬度、腸壁厚度和腸道直徑的增加[43]。在蘇保元[44]的試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽和Surfactin抗菌肽均可增加斜帶石斑魚的腸黏膜皺襞高度和肌層厚度。本試驗結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，飼料中添加桿菌七肽可改善草魚腸道黏膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)腸道消化吸收能力，從而促進(jìn)機(jī)體的生長，然而當(dāng)桿菌七肽用量過高時，其廣譜殺菌性會影響到腸道各類微生物的生長，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，影響腸道發(fā)育及腸道組織結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

本試驗條件下，桿菌七肽能提高血清抗氧化能力和免疫性能，改善腸道組織形態(tài)和功能，從而促進(jìn)生長，且添加量為7.5 mg/kg時效果較佳。