米 婷，王雅寧

(1.西安醫(yī)學院附屬寶雞醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，陜西 寶雞 721000； 2.寶雞市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 寶雞721004)

肺癌 (Lung cancer,LC)，作為一種醫(yī)學上嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其具有較高的發(fā)病率及病死率。由于其起源于肺部支氣管黏膜，也被稱為原發(fā)性支氣管肺癌 (Primary bronchogenic carcinoma,PBC)。有研究顯示，女性肺癌的發(fā)病率已超過乳腺癌發(fā)病率，占據(jù)惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，僅次于男性肺癌的發(fā)病率[1-3]。肺癌患者早起發(fā)病時臨床癥狀并不明顯，這就導致患者確診時大都處于晚期狀態(tài)，錯過了最佳治療時間。不可否認，近段時間以來，許多研究者進行了大量的實驗研究并發(fā)現(xiàn)了不少新的診斷方法和治療手段，但是肺癌的治療效果并沒有達到預期的效果，其近五年來生存率約17%，這說明我國治療肺癌的水平仍處于較低水平[4-8]。隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，氣管鏡由于操作方便在臨床上的應用越來越廣泛，尤其是在肺部疾病的治療中，同時也進一步提高了肺部疾病的診斷率[9-10]。

相關文獻報道顯示，肺癌的發(fā)生不僅是由環(huán)境外因導致的，遺傳、機體炎癥以及體內(nèi)微生物菌群等人體內(nèi)因一定程度上也對其發(fā)生起著作用[11-12]，某些特定的細菌與癌癥的發(fā)生密切相關。人體微生物菌群作為一個龐大的基因組，其能夠達到人體自身基因組的100倍，能夠維持人體內(nèi)環(huán)境平衡，從而保證生命安全[13-15]。隨著醫(yī)療技術的快速發(fā)展，宏基因組學檢測在基因組學檢測中發(fā)揮的作用越來越大，也向我們展現(xiàn)了菌群的基因多樣性，越來越多的人嘗試采用宏基因組學去探究人體菌群與各類疾病之間的相關性。近幾年來，大量研究表明，人類的飲食習慣以及生活習慣(吸煙、飲酒)很大程度影響著自身的菌群結構，而這些習慣往往容易致癌，因此，我們有理由相信菌群與癌癥發(fā)展之間存在一定的聯(lián)系。本研究通過運用支氣管鏡活檢探究宏基因組學二代測序技術診斷肺腺癌的臨床應用價值，旨在為肺癌的診斷方法提供新的可能，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019年9月至2020年2月西安醫(yī)學院附屬寶雞醫(yī)院診治的進行支氣管鏡檢查的患者中選擇32例肺癌患者(M組)，20例肺部非肺癌肺部疾病患者(MN組)和18例健康人群作為對照組(N組)。M組患者男17例，女15例，年齡42～58歲，平均(49.67±5.98)歲；MN組患者男11例，女10例，年齡44～60歲，平均(47.58±6.14)；N組患者男10例，女8例，年齡40～57歲，平均(48.39±5.62)歲。收集所有受試者的病史，并于術前對患者進行心電圖檢查、各項肺功能檢查、血常規(guī)和凝血功能檢查以及相關影像學檢查。三組患者年齡、性別等一般資料比較無統(tǒng)計學差異(均P<0.05)，具有可比性。①健康對照組病例納入標準：身體狀況良好；無其他惡性腫瘤、腦部疾病及心臟疾病患者；無肺部相關手術史患者；沒有哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 或其他慢性氣道疾病病史和非病理性呼吸道表現(xiàn)；患者在支氣管鏡檢查前沒有接受過化療、放療、手術或其他肺癌治療。排除標準：合并有免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)疾病患者；檢查前3個月內(nèi)使用過抗生素患者；行胸片檢查有疑似肺部病變；不適合進行支氣管檢查患者。②非肺癌肺部疾病組病例納入標準：無其他惡性腫瘤、腦部疾病及心臟疾病患者；無肺部相關手術史患者；患者存在肺癌之外的肺部疾病。排除標準：患者經(jīng)病理學檢查疑似存在肺癌；檢查前3個月內(nèi)使用過抗生素患者。③肺癌患者研究組病例納入標準：確診為肺腺癌患者；無其他惡性腫瘤、腦部疾病及心臟疾病患者；無肺部相關手術史患者。排除標準：經(jīng)病理確診為非腫瘤；術前3個月內(nèi)使用過抗生素患者。本研究已經(jīng)由西安醫(yī)學院附屬寶雞醫(yī)院倫理學會批準，所有患者及家屬均了解此次研究情況，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 咽拭子采樣方法：患者取坐位，取滅菌棉拭子越過舌根緩慢伸入咽后壁以及扁桃體側壁，旋轉擦拭一周，收集黏膜細胞，取出棉拭子時避免碰觸舌頭、懸垂體、口腔黏膜以及唾液。將棉拭子頭部放入滅菌凍存管中，與-80 ℃進行保存。檢測之前為了增加微生物的附著率，需使用無菌生理鹽水浸濕棉拭子。

1.2.2 肺泡灌洗液收集方法：研究對象在進行支氣管鏡檢查之前，為確?；颊甙踩?，需采用霧化劑進行局部麻醉處理，之后使用咪達唑侖與芬太尼進行鎮(zhèn)靜處理。將支氣管鏡從鼻腔插入，經(jīng)咽喉到達氣管和支氣管。在支氣管鏡達到舌葉或中葉開口處時，注射適當?shù)睦嗫ㄒ蜻M行麻醉，緊接著將60 ml 0.9%的氯化鈉溶液注入管腔進行灌注，回收率≥30%時認定為樣本合格，收集得到的肺泡灌洗液進行后續(xù)檢測。

1.2.3 DNA 提取及測序：使用珠打法從氣道樣品中分離細菌 DNA。使用巢式 PCR 對細菌16S rRNA的 V3-V4區(qū)域進行擴增。使用 Miseq 平臺對擴增子進行測序。使用 USEARCH 8.0 從原始數(shù)據(jù)中提取干凈的數(shù)據(jù)。 使用 UPARSE 去除嵌合序列后，基于 97% 的相似性對操作分類單元(Operational taxonomic units，OTU)進行分類。通過 RDP 分類器針對 Silva (SSU 123) 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫在使用 70% 的置信閾值的基礎下對每個 16s rRNA 基因序列的系統(tǒng)衍生的從屬關系進行分析。

1.2.4 觀察以及評價指標：①采用shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)來比較不同組別研究對象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群組間分類的多樣性的差異；②比較三組對象在菌門分類等級上的物種豐度差異；③采用準確率和精度作為評價性指標來衡量肺泡灌洗液中不同菌屬對鑒別肺癌的診斷價值的真實性。

2 結 果

2.1 三組研究對象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群多樣性比較 對于咽部微量菌群而言，N組與MN組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，與M組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均有明顯降低(均P<0.05)；對于肺泡灌洗液微量菌群而言，M組與MN組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，與N組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均有明顯升高(均P<0.05)。見表1。

表1 三組研究對象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群多樣性比較

2.2 三組研究對象在門分類等級上物種豐度差異比較 對于咽部微量菌群而言，常見的菌門分別為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門與梭桿菌門，其中厚壁菌門以及梭桿菌門在物種豐度上比較具有統(tǒng)計學差異，M組與MN組患者厚壁菌門與梭桿菌門豐度比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，N組患者厚壁菌門豐度明顯較低(P<0.05)，梭桿菌門豐度明顯較高(P<0.05)。見表2。對于肺泡灌洗液微量菌群而言，常見的菌門分別為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、放線菌門與螺桿菌門，其中厚壁菌門、梭桿菌門以及放線菌門在物種豐度上比較具有統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，M組與MN組患者厚壁菌門與梭桿菌門豐度比較無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)，N組患者厚壁菌門豐度明顯較低(P<0.05)，梭桿菌門豐度明顯較高(P<0.05)；M組與N組患者放線菌門豐度比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，MN組患者放線菌門豐度明顯較高(P<0.05)。見表3。

表2 三組研究對象咽部微量菌群在菌門分類等級上物種豐度差異比較(%)

表3 三組對象肺泡灌洗液微量菌群在菌門分類等級上物種豐度差異比較(%)

2.3 肺泡灌洗液中不同菌屬對鑒別肺癌診斷價值 運用準確度和精度評價診斷由宏基因組學二代測序技術預測出的鑒別肺癌價值較高的三個菌屬葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬，見圖1、2。

圖1 葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬診斷肺癌準確度

圖2 葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬診斷肺癌精度

3 討 論

在我們的研究中，我們對肺癌患者的咽部以及肺泡灌洗液進行了采樣，并將它們與來自配對的非癌側的樣本以及來自“健康”對照的樣本進行了比較。 我們的分析表明，肺癌患者體內(nèi)的微生物群落與“健康”對照組的微生物群落是有區(qū)別的，肺癌患者肺微生物群組成的改變不僅限于癌組織。據(jù)我們所知，我們第一次記錄了鏈球菌屬在肺癌患者中的含量豐富，并表現(xiàn)出中等分類潛力。此外，其他重要發(fā)現(xiàn)包括鏈球菌屬在肺癌患者中較高，而葡萄球菌在“健康”對照中更高。還觀察到樣本中氣道微生物群譜從“健康”對照到非癌區(qū)域到配對癌區(qū)域的逐漸“轉變”。這些數(shù)據(jù)為了解下呼吸道微生物與肺癌的關系提供了初步見解，并強調(diào)了呼吸道失調(diào)與肺癌之間的相互影響。到目前為止，三項使用下一代測序的研究表征了肺癌患者的肺微生物組。在對中國 8 例從不吸煙女性肺癌病例和 8例從不吸煙女性對照的痰液取樣進行的小規(guī)模研究中，在肺癌病例中觀察到鏈球菌屬、鏈球菌屬水平顯著富集[16-18]。在我們的研究中，病例組中鏈球菌屬始終豐富，與我們的發(fā)現(xiàn)一致。 然而，后一組中兩組在多樣性上沒有差異。異質性可能與地域和種族差異、方法學差異以及樣本類型的代表性或分組設計的合理性有關。 最近，對肺微生物組進行了迄今為止規(guī)模最大的研究，其中包括微生物分析中的 165 個非惡性和 31 個配對腫瘤樣本[19]。配對腫瘤的多樣性降低也與我們的結果一致。我們的研究為表征肺癌患者非惡性肺組織的肺微生物組提供了有力的依據(jù)。 然而，非惡性組織和配對腫瘤樣本的比較僅限于肺癌患者的細菌多樣性分析，我們的研究缺乏與健康對照受試者的肺微生物組的比較，這限制了定義肺微生物作用的能力。在我們的研究中，與來自對照組的樣本相比，來自癌變部位的下呼吸道樣本具有顯著較低的群落多樣性。 這一發(fā)現(xiàn)與前兩項使用痰和肺組織樣本對肺癌微生物群落進行的研究相一致。細菌多樣性的一致差異表明，在某些疾病條件下，氣道微生物群可能在數(shù)量和質量方面發(fā)生變化[20]。 這些發(fā)現(xiàn)可以結合到“癌癥衛(wèi)生假說”中，以假設癌癥發(fā)病率的增加可能與衛(wèi)生條件的增加/特定微生物接觸的減少有關，類似于已知的自身免疫性疾病和過敏癥[21]。 然而，我們不能完全排除替代假設，即觀察到的多樣性變化可能只是腫瘤進展的被動副產(chǎn)品。

本研究探索氣管鏡下宏基因組學二代測序技術在鑒別診斷肺癌的臨床應用價值。采用宏基因組學二代測序技術分析三組研究對象咽部的菌群特征，對三組研究對象上呼吸道菌群與下呼吸道菌群的差異進行了比較分析；同時通過對肺癌患者進行代謝組學分析，找出了臨床上肺癌患者確診的潛在標志物。結果顯示，宏基因組學二代測序技術用來預測診斷肺癌是有一定運用價值的。葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬可作為肺癌診斷的潛在標志物。本文的不足之處在于研究對象數(shù)目較少，結果偏單一，使結果容易產(chǎn)生誤差，以后的研究擴大研究范圍是有必要的。