陳良強(qiáng)，張巧玲，楊 帆，王 莉

（貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501）

對(duì)于中國(guó)名優(yōu)白酒而言，大曲不僅起到提供原料供給、糖化發(fā)酵的作用，其所含大量風(fēng)味物質(zhì)會(huì)直接或間接地進(jìn)入到酒體中，對(duì)白酒的香型、風(fēng)味品格具有重要的影響[1-3]。大曲的風(fēng)味香氣特性主要受到制曲原料、工藝條件和微生物群系的影響。近年來，越來越多的研究者將目光聚焦在醬香型白酒釀造過程所使用的高溫大曲，對(duì)醬香型白酒高溫大曲的微生物組成、風(fēng)味組成進(jìn)行研究[4-7]，明確了高溫大曲中部分菌株對(duì)基酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)，如發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌（Bacillus）主要代謝具有烘焙香的吡嗪類物質(zhì)[8]，以及擬青霉（Paecilomyces）主要代謝具有花香的苯乙醇物質(zhì)等[9]。

庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）是白酒釀造過程重要的酵母菌，通過ITS擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)表明P.kudriavzevii是醬香型白酒發(fā)酵微生物群落中的核心酵母[10]，具有良好的耐受性，能夠在極端環(huán)境下快速生長(zhǎng)[11]。同時(shí)，P.kudriavzevii可代謝產(chǎn)生多種重要風(fēng)味物質(zhì)，產(chǎn)酯種類多，能力強(qiáng)[12]，對(duì)醬香型白酒風(fēng)味代謝產(chǎn)物形成有重要作用[13-15]。有研究表明，醬香型白酒高溫大曲在前期發(fā)酵過程中存在大量的酵母菌，主要包括畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）和釀酒酵母屬（Saccharomyces）等，但隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵后期酵母菌數(shù)量急劇減少[16]，其中，P.kudriavzevii是高溫大曲中除霉菌外相對(duì)占比較高的酵母菌[17]，關(guān)于該過程中酵母菌的生長(zhǎng)代謝對(duì)大曲風(fēng)味品質(zhì)的影響的研究還較少。

小麥作為醬香型白酒高溫大曲釀造的唯一原料[18]，其品種對(duì)大曲風(fēng)味的調(diào)控和作用并不明確。為探索醬香型白酒制曲原料對(duì)風(fēng)味的調(diào)控作用，本研究擬選取了制曲生產(chǎn)常用的不同品種小麥為原料，接入大曲中的優(yōu)勢(shì)酵母菌之一—P.kudriavzevii進(jìn)行純種發(fā)酵，初步研究小麥品種對(duì)酵母風(fēng)味代謝特征的影響，同時(shí)，對(duì)不同品種小麥中游離氨基酸與酵母代謝的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行典型關(guān)聯(lián)分析（canonical correlation analysis，CCA），考察不同品種小麥中游離氨基酸的差異對(duì)發(fā)酵風(fēng)味的影響，為篩選獲得更適合生產(chǎn)醬香型白酒高溫大曲的小麥品種提供一定參考借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與原料

庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）MT-Y01：分離于貴州茅臺(tái)酒釀造過程，保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）；小麥：取自不同省份，共8種不同品種，分別為豫麥18（M1）、百農(nóng)201（M2）、淮麥32（M3）、天民198（M4）、鄭麥1769（M5）、鄂麥596（M6）、鄭麥1354（M7）和徐麥35（M8）。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH自然。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L，115 ℃高壓蒸汽滅菌15～20 min。

小麥發(fā)酵培養(yǎng)基[19]：取15 g粉碎后的小麥于250 mL三角瓶中，加入100 mL無菌水，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂（均為分析純或生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基酸化合物標(biāo)準(zhǔn)品、香茅醇（均為分析純）：美國(guó)Sigma Aldrich公司；磺基水楊酸（分析純）：中國(guó)BBI生命科學(xué)公司；Ultra Physiological FluidChenicalKit：英國(guó)Biochrmo公司；糖化酶（10萬U/mL）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀：美國(guó)Agilent公司；Biochrom 30+氨基酸分析儀：英國(guó)Biochrom公司；MIKRO 220R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hettich公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥基本理化性質(zhì)的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[20]：參照GB/T 5511—2008《谷物和豆類氮含量測(cè)定和粗蛋白質(zhì)含量計(jì)算凱氏法》。

硬度的測(cè)定[21]：參照GB/T 21304—2007《小麥硬度測(cè)定硬度指數(shù)法》。

總淀粉及支鏈淀粉含量的測(cè)定：取烘干的小麥籽粒用實(shí)驗(yàn)室粉碎機(jī)打成粉末狀態(tài)，參照文獻(xiàn)[22]的方法。

1.3.2 小麥游離氨基酸的測(cè)定采用茚三酮衍生法對(duì)小麥游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，具體方法見參考文獻(xiàn)[23]。

1.3.3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

種子液的制備：將庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）MT-Y01劃線于YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，然后利用接種環(huán)挑選平板上的單菌落接種于裝液量為50 mL/250 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

小麥發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：在小麥發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5 mL無菌糖化酶，然后將P.kudriavzeviiMT-Y01種子液接種于小麥發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后液體培養(yǎng)基中初始細(xì)胞濃度為106CFU/mL，30 ℃、180 r/min發(fā)酵3 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定[12]

樣品前處理：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL裝于頂空進(jìn)樣瓶中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)（香茅醇），香茅醇在體系中的終質(zhì)量濃度為1.021 mg/L，最后加入3 g氯化鈉。通過頂空固相微萃取技術(shù)（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）進(jìn)行萃取，再利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

氣相色譜條件：柱溫初始溫度為60 ℃，以6 ℃/min的升溫速率升至230 ℃，停留15 min；柱流量1.6 mL/min，采用恒壓模式；進(jìn)樣口溫度230 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；采用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍35～550amu；溶劑延遲時(shí)間5 min。

定性定量方法：將未知物質(zhì)圖譜與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）08a.L Database中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行定性分析。采用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行歸一化處理，然后利用R語(yǔ)言的pheatmap程序包繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析；利用Vegan程序包進(jìn)行氨基酸與風(fēng)味的CCA[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種小麥基本理化性質(zhì)的分析

8種小麥的基本理化性質(zhì)見表1。由表1可知，各品種小麥硬度存在較大差異，根據(jù)小麥硬度指數(shù)分類標(biāo)準(zhǔn)[25]，鄂麥596和徐麥35為軟質(zhì)麥，淮麥32為硬質(zhì)麥，其余小麥均為混合麥。各品種小麥的粗蛋白、淀粉含量存在差異，其中鄂麥596（M6）和鄭麥1769（M5）的粗蛋白含量低，分別為11.3%和12.6%；徐麥35（M8）粗蛋白含量最高，達(dá)到16.6%。各品種小麥的總淀粉含量在60%～67%，其中鄂麥596（M6）的總淀粉含量最高（66.7%），淮麥32（M3）的總淀粉含量最低（60.4%）。不同品種小麥支鏈淀粉占比（36.8%～51.6%）的差異較大，徐麥35支鏈淀粉占比最低為36.8%。以上結(jié)果表明，8種小麥的基本理化特性存在一定的差異。研究表明，小麥硬度、粗蛋白、硬度等理化指標(biāo)與其所制大曲質(zhì)量相關(guān)[26-28]，因此，推測(cè)不同品種小麥理化特性可能對(duì)P.kudriavzeviiMT-Y01的發(fā)酵特性產(chǎn)生影響。

表1 不同小麥品種基本理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of basic physical and chemical indexes of different wheat varieties

2.2 不同品種小麥游離氨基酸的分析

不同品種小麥中游離氨基酸的組成及含量見表2。

表2 不同品種小麥游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of free amino acids in different wheat varieties

由表2可知，從8種小麥中均檢測(cè)到19種氨基酸，不同品種小麥的氨基酸組成結(jié)構(gòu)較為相似，與吳琴燕等[29]的研究結(jié)果一致。但8種小麥在氨基酸的含量上存在一定的差異，其中鄭麥1769（M5）、豫麥18（M1）、徐麥35（M8）和鄭麥1354（M7）的游離氨基酸含量明顯高于其他品種小麥，分別為2 763.9 μg/g、2 298.6 μg/g、2 288.5 μg/g和2 194.1 μg/g，小麥游離氨基酸含量的升高可能增加發(fā)酵環(huán)境中的游離氨基酸水平。不同品種小麥絲氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸存在較大差異。絲氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸等氨基酸在畢赤酵母發(fā)酵過程中能有效積累，酵母菌在氨基酸代謝中展現(xiàn)出特征代謝物、代謝強(qiáng)度的差異[30]，這些差異很可能與最終風(fēng)味物質(zhì)的差異存在一定的聯(lián)系。

2.3 發(fā)酵小麥揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

8種小麥分別經(jīng)P.kudriavzeviiMT-Y01有氧發(fā)酵后，測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，不同品種小麥對(duì)P.kudriavzeviiMT-Y01的代謝特性影響較大。從總風(fēng)味物質(zhì)含量上看，發(fā)酵后的鄂麥596（M6）中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量最高，為568.5 mg/L；發(fā)酵后的天民198（M4）和鄭麥1769（M5）中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量較低，分別為127.2 mg/L和96.8 mg/L；其他5種小麥發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量在209.8～348.5 mg/L范圍內(nèi)。從代謝物質(zhì)類型上看，以小麥為基質(zhì)，P.kudriavzevii的主要代謝產(chǎn)物為高級(jí)醇和酯類物質(zhì)，占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的80%以上。

圖1 庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母MT-Y01以不同品種小麥為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及總含量Fig.1 Types and total contents of volatile flavor compounds produced by Pichia kudriavzevii MT-Y01 fermented with different wheat varieties

進(jìn)一步分析各品種小麥對(duì)P.kudriavzeviiMT-Y01代謝不同風(fēng)味物質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，P.kudriavzeviiMT-Y01在這8種小麥為基質(zhì)條件下主要代謝31種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)都是醬香型白酒中重要的風(fēng)味化合物，包括3種醇類、7種酸類、9種酯類和12種其他類風(fēng)味物質(zhì)。從不同風(fēng)味物質(zhì)種類及含量上看，利用不同品種小麥為基質(zhì)，P.kudriavzeviiMT-Y01的代謝產(chǎn)物有較大差異：以鄂麥596（M6）為基質(zhì)時(shí)，各代謝產(chǎn)物含量均較高，與其他品種小麥的代謝特點(diǎn)有顯著不同；以天民198（M4）和鄭麥1769（M5）為基質(zhì)時(shí)，各代謝產(chǎn)物含量均較低；以百農(nóng)201（M2）為基質(zhì)時(shí)，P.kudriavzeviiMT-Y01代謝產(chǎn)生的3-甲硫基丙醇含量最高，為0.39 mg/L；以淮麥32（M3）為基質(zhì)時(shí)，P.kudriavzeviiMT-Y01代謝產(chǎn)生的己酸乙酯含量最高，為0.45 mg/L；以徐麥35（M8）為基質(zhì)時(shí)，P.kudriavzeviiMT-Y01代謝產(chǎn)生的苯甲醛含量最高，為1.51 mg/L。結(jié)果表明，不同小麥基質(zhì)影響P.kudriavzevii代謝揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的特性。

圖2 庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母MT-Y01以不同品種小麥為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖Fig.2 Heat map of volatile flavor compounds produced by Pichia kudriavzevii MT-Y01 fermented with different wheat varieties

2.4 小麥氨基酸與酵母代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的典型關(guān)聯(lián)分析

營(yíng)養(yǎng)底物對(duì)酵母的代謝有重要的影響，發(fā)酵過程中，氨基酸為酵母生長(zhǎng)代謝提供營(yíng)養(yǎng)成分，參與胞內(nèi)氨基酸和蛋白質(zhì)的生物合成，以及為副產(chǎn)物代謝提供前體物質(zhì)[31]。不同種類的氨基酸參與不同的風(fēng)味代謝途徑，因此小麥中氨基酸的種類組成及含量對(duì)酵母發(fā)酵性能和風(fēng)味形成有著顯著影響[32-34]。將小麥中的氨基酸與酵母MT-Y01代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行典型關(guān)聯(lián)分析，考察不同小麥品種氨基酸的差異對(duì)發(fā)酵風(fēng)味的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 小麥游離氨基酸與酵母代謝風(fēng)味物質(zhì)的典型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Fig.3 Results of canonical correlation analysis between free amino acids in wheat and flavor substances metabolized by Pichia kudriavzevii MT-Y01

由圖3可知，3-甲基丁醇、苯乙醇、3-甲基丁酸、苯乙醛、丙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯這7種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與19種氨基酸關(guān)聯(lián)性強(qiáng)，其中3-甲基丁醇與纈氨酸相關(guān)性強(qiáng)，苯乙醇與苯丙氨酸相關(guān)性強(qiáng)，表明高級(jí)醇（3-甲基丁醇、苯乙醇）的合成受到其對(duì)應(yīng)氨基酸的影響大，推測(cè)主要是因?yàn)楦呒?jí)醇通過氨基酸分解代謝（Ehrlich途徑）形成[35-36]。3-甲基丁酸受天冬氨酸和天冬酰胺影響大，在研究葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)與氨基酸關(guān)系中曾發(fā)現(xiàn)，葡萄酒中的3-甲基丁酸與葡萄汁中天冬氨酸、蛋氨酸成正相關(guān)，與組氨酸成負(fù)相關(guān)，與本研究結(jié)果較為一致[37]。苯乙醛受精氨酸影響大，丙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯與酸類、醇類呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，受亮氨酸、半胱氨酸和賴氨酸影響大。在發(fā)酵過程中，酯類物質(zhì)是在酵母細(xì)胞內(nèi)由?；o酶A及脂肪酸和醇類在相關(guān)酶的催化作用下生成的，主要分為乙酸酯和乙基酯兩類[38-39]。酵母對(duì)酯類物質(zhì)的合成主要受到基質(zhì)中氨基酸種類和含量的影響[36]，相關(guān)研究表明，提高基質(zhì)中氨基酸濃度有利于酯類物質(zhì)的合成[40]。

3 結(jié)論

本研究初步分析了不同小麥品種對(duì)P.kudriavzeviiMT-Y01風(fēng)味代謝特性的影響。結(jié)果表明，8種小麥的基本理化指標(biāo)存在一定的差異，游離氨基酸組成相似，但含量存在較大差異。P.kudriavzeviiMT-Y01以小麥為基質(zhì)時(shí)代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為高級(jí)醇和酯類物質(zhì)，占總風(fēng)味物質(zhì)含量的80%以上。但小麥品種不同，其代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量和種類有較大差異，酵母MT-Y01以小麥品種鄂麥596為基質(zhì)時(shí)，代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量最高，為568.5 mg/L；以小麥品種天民198和鄭麥1769為基質(zhì)時(shí)，代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量較低，分別為127.2 mg/L和96.8 mg/L；以百農(nóng)201（M2）為基質(zhì)時(shí)，代謝產(chǎn)生的3-甲硫基丙醇含量最高；以淮麥32（M3）為基質(zhì)時(shí)，代謝產(chǎn)生的己酸乙酯含量最高；以徐麥35（M8）為基質(zhì)時(shí)，代謝產(chǎn)生的苯甲醛含量最高。同時(shí)，對(duì)不同品種小麥中游離氨基酸與酵母代謝的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)不同種類的氨基酸參與不同的風(fēng)味代謝途徑，對(duì)酵母代謝風(fēng)味形成有著顯著影響。其中，3-甲基丁醇與纈氨酸相關(guān)性強(qiáng)，苯乙醇與苯丙氨酸相關(guān)性強(qiáng)，3-甲基丁酸與天冬氨酸和天冬酰胺相關(guān)性強(qiáng)，苯乙醛受精氨酸影響大，丙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯與酸類、醇類呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，受亮氨酸、半胱氨酸和賴氨酸影響大，說明小麥品種氨基酸的差異將影響大曲發(fā)酵過程風(fēng)味物質(zhì)的形成，并可能進(jìn)一步影響白酒的風(fēng)味品質(zhì)。本研究對(duì)于篩選合適的小麥品種進(jìn)行大曲生產(chǎn)具有一定的借鑒意義。