趙萬樂，朱松波，李艷玲,楊玉榮,陳二平

（鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所，河南 鄭州 450005）

分離X、Y精子，用于人工授精，是目前畜牧業(yè)生產(chǎn)中實現(xiàn)性別控制的重要手段。由于X 精子和Y 精子所攜帶的性染色體不同，這2種類型的精子之間就必然存在著某些性狀差異，這就使得利用某種相應(yīng)方法把它們分離開來成為可能，但須保證分離操作不使特定類型精子的受精力受到損害。

1 X、Y精子分離的生物學(xué)基礎(chǔ)

多年來，人們幾乎都是利用X、Y 精子之間的某些差異來分離不同類型的精子。如檢查Y精子上的F小體、區(qū)別X、Y精子頭部大小、X、Y精子的重量及比重上的差異、精子外膜電荷上的差異、抗原性的差異及耐酸堿性上的差異等等（見下表）。

到目前為止，除X、Y 精子的DNA 含量的差異可以肯定之外，其他方面的差異甚微或者難以確切地證明，此外，這些差異還常常隨各種環(huán)境條件的不同而變化。因此，對兩類精子某些差異的研究還存在著爭議。

2 X、Y精子分離方法及研究進(jìn)展

目前已有諸多關(guān)于X、Y 精子分離技術(shù)的報道，如密度梯度離心法、電泳法、流式細(xì)胞分選法等。

2.1 白蛋白梯度游動分離法

該方法的原理基礎(chǔ)是：Y 精子的體積比X 精子小，并且在高密度的人血清白蛋白液柱中向下游動的速度比較快，通過丟棄白蛋白柱上層，收集底部22%的部分而得到富集Y精子液體。

然而，這種精子分離方法一直以來不斷受到質(zhì)疑，而且從來沒有在除了人類以外的哺乳動物上獲得成功。再者，這一方法只能純化Y精子群，不能得到X精子群，這勢必會影響其推廣和應(yīng)用。

2.2 自由電泳分離法［2］

自由電泳分離法是根據(jù)X 精子和Y 精子的表面電荷可能存在差別的原理，將精子放入特制的電泳容器，加以一定持續(xù)電場，使得兩種電荷量不同的精子朝著不同的路徑泳動而得以分離。

應(yīng)用該方法進(jìn)行人類精子的分離試驗時，用F檢驗分析表明，分離得到的X 精子樣本相對純度高一些，而Y 精子純度就比較差，但是分離后的精子受到了很大的影響，活力大大降低。況且，不同實驗室用該方法得到的結(jié)果不盡相同甚至相反，有的認(rèn)為是X精子表面攜帶的負(fù)電荷比較多，電泳過程中將會趨向陽極。有關(guān)專家認(rèn)為，試驗結(jié)果的差異可能是由于精子成熟過程或活力變化時其表面電荷會隨之改變所導(dǎo)致的。

表 X精子和Y精子的差異比較［1］

2.3 離心沉積分離法［3］

在一定的溶液中，X 精子的沉降速率比Y 精子快。在國內(nèi)，曹世禎等［3］報道利用Percoll 梯度進(jìn)行精子分離，分離后用富含Y 精子的精液人工授精所生產(chǎn)的后代雌雄比例為4 613∶5 317；利用富含X 精子的精液人工授精所生產(chǎn)的后代雌雄比例為6 514∶3 416。為什么X精子的沉降速率比Y 精子稍快呢？有關(guān)專家認(rèn)為，這是因為X 精子和Y 精子之間重心的差異促使X 精子更容易通過各個密度梯度之間的界面。該方法分離得到的X、Y 精子的結(jié)果不穩(wěn)定，缺乏重復(fù)性，不同的實驗室得到不一致的結(jié)果，甚至還有人用同樣的方法分離不開X 精子和Y 精子。

2.4 精子體積差異分離法

該方法依據(jù)X 精子體積比Y 精子體積要大的原理。該方法吸引人之處在于進(jìn)行精子分離時不需要DNA 染料。但是該方法實際分離并沒有達(dá)到理論預(yù)計的效果，X精子或Y精子分離純度都沒有達(dá)到80%以上。

2.5 精子差異膜蛋白分離方法［4］

這些技術(shù)手段主要有二維電泳、高效液相色譜、蛋白質(zhì)芯片等。這些技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展為分離和鑒別X、Y 精子間細(xì)微差異膜蛋白提供了新的技術(shù)方法。

2.6 流式細(xì)胞儀分離法

用流式細(xì)胞分離儀分離哺乳動物X、Y精子的性別控制技術(shù)，是根據(jù)哺乳動物X 精子的DNA 含量比Y 精子多的原理，利用特異性熒光染料將精子的DNA染色，然后通過流式細(xì)胞儀將X精子和Y精子分離，并通過人工授精或體外受精等技術(shù)，按人們的愿望使雌性動物繁殖出所需性別后代的一種繁殖新技術(shù)。目前，流式細(xì)胞儀精子分離技術(shù)已經(jīng)成為科學(xué)、可靠、高效的性別控制方法之一，但此技術(shù)成本高，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中推廣受限。

2.7 H-Y抗原免疫法

利用免疫學(xué)方法分離精子是從發(fā)現(xiàn)H-Y抗原后逐漸發(fā)展起來的。經(jīng)研究，H-Y抗原特異表達(dá)于Y精子細(xì)胞膜上。因而，利用H-Y抗體檢測質(zhì)膜上存在的H-Y抗原，再通過一定的分離程序，就可以將精子分離成為Y精子和X精子兩類。然而，研究者在用抗H-Y 抗原抗體對流式細(xì)胞儀精確分離出來的精子樣品進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，不僅是Y精子，X精子也能結(jié)合抗H-Y抗原抗體。因此，在本質(zhì)上X、Y精子之間會共享抗原，利用免疫手段分離X、Y精子在現(xiàn)有的技術(shù)條件下還很難取得實質(zhì)性進(jìn)展。

3 X、Y精子分離后的應(yīng)用效果［5］

3.1 精子分離的效果

流式細(xì)胞分選法是目前比較成功的分離X、Y精子的方法，可以獲得純度較高的單一精子。例如分離人精子時，X 精子的分離純度可達(dá)80%～90%，Y 精子的分離純度可達(dá)60%～70%；分離豬和牛的精子時，其純度達(dá)85%～98%。

3.2 精子分離后的人工授精（AI）

在提高家畜品種改良效率和增加優(yōu)良種畜后代數(shù)量的各種技術(shù)中，Al最具影響力，Al技術(shù)與精子分離技術(shù)將對畜牧業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生無法估量的作用。據(jù)有關(guān)報道，冷凍分離精子的授精劑量為100 萬～150 萬個精子與300 萬個精子的妊娠率沒有差異，用X精子授精后所產(chǎn)犢牛的性別準(zhǔn)確率為83%，Y 精子為90%，并且犢牛的生長發(fā)育沒有任何異?，F(xiàn)象。在豬、馬和羊方面，運(yùn)用分離精子進(jìn)行Al都有成功報道。

4 展望

綜上所述，在各種精子分離方法中，免疫學(xué)方法與流式細(xì)胞儀分離法具有巨大的發(fā)展?jié)摿εc廣泛的應(yīng)用前景，可以相信，隨著研究的深入，更加快速簡便、準(zhǔn)確率高、費(fèi)用低且可以用于大規(guī)模生產(chǎn)的精子分離是可以實現(xiàn)的。

從根本上講，控制動物性別最理想的方法是先分離X、Y精子，再采用相應(yīng)性別的精子進(jìn)行人工授精或體外受精，得到所需性別的后代。隨著科技的進(jìn)步、先進(jìn)儀器的誕生，人類將最終實現(xiàn)按需要自由控制家畜性別的夢想。