趙婉彤 崔 穎

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，發(fā)生率約占頭頸部腫瘤的20%，大部分源于喉黏膜上皮組織，以鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)為主。喉癌是一種受環(huán)境和生活方式相關(guān)因素影響的多因素疾病[1]。喉癌患者的生活質(zhì)量雖然隨著診療水平的提高有所改善，但其3～5年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍較高，危及患者生命。因此，進(jìn)一步探討喉癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，積極尋找治療的新靶點(diǎn)，提高喉癌患者的生活質(zhì)量及生存率已成為新的熱點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡抑制因子(IAPs)是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生存的重要因子[2]，能夠阻斷細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞增殖。c-IAP1是其重要組成成員，作用機(jī)制是抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過BIR結(jié)構(gòu)域與相應(yīng)的Caspase結(jié)合，抑制其激活，從而抑制凋亡。Caspase家族是一類獨(dú)特的半胱氨酸蛋白酶[3]，是哺乳動(dòng)物凋亡機(jī)制的基本組成部分，可作為細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡的效應(yīng)物，其中Caspase-3是調(diào)控凋亡最關(guān)鍵的酶之一。細(xì)胞凋亡需要Caspase的蛋白水解激活，Caspase被合成為潛在的前體酶。一旦被激活，Caspase就會(huì)切割出廣泛的分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞分解。因此，Caspase在細(xì)胞內(nèi)受到嚴(yán)格控制?；钚訡aspase可以被凋亡抑制因子(IAPs)特異性地抑制。

目前，c-IAP1及Caspase-3已被證實(shí)在多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究通過免疫組化檢測(cè)喉癌及其對(duì)應(yīng)癌旁正常上皮組織中c-IAP1和Caspase-3蛋白的陽性表達(dá)率，初步探討了c-IAP1和Caspase-3蛋白與喉癌臨床病理特征的關(guān)系，并分析上述兩種蛋白在喉癌中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，以期為喉癌的發(fā)生發(fā)展提供一個(gè)初步的理論依據(jù)。

圖1 c-IAP1和Caspase-3蛋白在喉癌和癌旁正常組織中的表達(dá)(DAB法X200)

1.資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2015年1月至2017年1月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科60例手術(shù)切除且病理學(xué)診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌患者的石蠟切片及對(duì)應(yīng)癌旁正常上皮組織(距癌腫切緣0.5cm以上，經(jīng)病理確認(rèn))。所有患者均為初次治療且術(shù)前均未行放化療治療。其中，男性55例，女性5例，年齡55～70歲，平均年齡64.27歲；TNM分期：T1期9例，T2期25例，T3期19例，T4期7例；喉癌分型：聲門上型17例，聲門型38例，跨聲門型5例；分化程度：高分化30例，中分化25例，低分化5例；術(shù)后病理回報(bào)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均已簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 ab108361 Anti-c-IAP1(100μl/支)購自美國Abcam公司，14220T Caspase-3 Antibody(100μl/支)購自美國CST公司，山羊抗兔多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法 本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各個(gè)組織中c-IAP1及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。具體步驟如下：①將恒溫箱預(yù)熱到60℃，放入石蠟切片，烤片1h。②脫蠟：置于二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min。③水化：置于無水乙醇3min(2次)、95%乙醇3min(2次)、90%乙醇3min、85%乙醇3min、蒸餾水1min、PBS溶液洗滌3min(3次)。④熱抗原修復(fù)：使用微波爐加熱。將片子置于檸檬酸鹽溶液中，80℃下加熱8min，然后放入室溫冷卻8min，再次于40℃下加熱8min，然后冷卻至室溫。⑤PBS溶液洗滌3min(3次)。⑥擦凈片子上的液體，用免疫組畫筆畫圈。⑦加阻斷劑(內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑)，等待10min后，PBS溶液洗滌3min(3次)。⑧加山羊血清封閉(封閉用正常山羊血清工作液)，等待10～15min。⑨滴加一抗(c-IAP1：1：500；Caspase-3：1:100)后放于免疫組化濕盒中，4℃孵育過夜。⑩隔天將片子恢復(fù)室溫，PBS溶液洗滌3min(3次)。滴加二抗(生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG)，等待10～15min，PBS溶液洗滌3min(3次)。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，等待10～15min，PBS溶液洗滌3min(3次)。顯色：滴加DAB溶液，等待5～8min，用自來水沖洗。復(fù)染：滴加蘇木素，等待20s后自來水沖洗。滴加鹽酸乙醇分化液1s后自來水沖洗。脫水：置于95%乙醇2min(2次)、無水乙醇2min(2次)。透明：置于二甲苯2min(2次)。封片：滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片，晾干備用。其中陰性對(duì)照將一抗替換為0.01MPBS～0.01%Triton液，其他條件保持不變。染色結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下觀察并進(jìn)行判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或fisher確切概率法，組間關(guān)聯(lián)性采用spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 c-IAP1和Caspase-3在喉癌組織和癌旁正常上皮組織中的表達(dá)情況 c-IAP1蛋白在喉癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常上皮組織(P<0.01)，而Caspase-3蛋白的陽性表達(dá)率在喉癌組織中明顯低于癌旁正常上皮組織(P<0.01)，見表1、表2、圖1。

表1 喉癌和癌旁正常上皮組織中c-IAP1的表達(dá) 單位：例(%)

表2 喉癌和癌旁正常上皮組織中Caspase-3的表達(dá) 單位：例(%)

2.2 c-IAP1和Caspase-3在喉癌中表達(dá)情況與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 在60例喉鱗癌患者中，c-IAP1和Caspase-3蛋白的表達(dá)與吸煙、飲酒、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期具有相關(guān)性(P<0.05)，而與年齡、性別、臨床分型無相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表3 喉癌組織中c-IAP1和Caspase-3的表達(dá)與臨床及病理學(xué)特征的關(guān)系(例) 單位：例

續(xù)表3

2.3 c-IAP1和Caspase-3蛋白在喉癌組織中表達(dá)的Spearman等級(jí)相關(guān)分析 在60例喉鱗狀細(xì)胞癌中，c-IAP1和Caspase-3蛋白同時(shí)陽性表達(dá)5例，同時(shí)陰性表達(dá)4例；c-IAP1蛋白在喉癌組織的陽性表達(dá)與Caspase-3蛋白在喉癌組織的陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)，見表4。

表4 喉癌組織中c-IAP1與Caspase-3的組間等級(jí)相關(guān)性分析 單位：例

3.討論

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞死亡，對(duì)多細(xì)胞生物體的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。細(xì)胞死亡過多和不足都會(huì)導(dǎo)致異?；蚣膊?。參與凋亡的分子機(jī)制在不同物種間高度保守。Caspase是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介導(dǎo)因子，是一類天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，它將底物切割在天冬氨酸殘基的羧基側(cè)。目前已知至少有14種不同的Caspase存在[4]，其中2/3在細(xì)胞凋亡中起作用。參與細(xì)胞凋亡的Caspase可分為兩大類，即啟動(dòng)子Caspases和下游效應(yīng)Caspases。其中Caspase-3是目前研究最廣泛的效應(yīng)因子，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成員在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞遷移和有絲分裂等方面也發(fā)揮了重要作用[5]。該家族由8種蛋白組成(阿波羅龍、c-IAP1、c-IAP2、ILP-2、Livin、Naip、Survivin、XIAP)，它們?cè)诩?xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。所有IAP都有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)特征：它們顯示一個(gè)或多個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)域，直接負(fù)責(zé)這些蛋白質(zhì)的抗凋亡功能。已有令人信服的證據(jù)表明，c-IAP1通過與caspase-3結(jié)合抑制細(xì)胞死亡，并廢除了它們的促凋亡功能。

從Varfolomeev Eugene等[6]的報(bào)道中可知c-IAP1是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)NF-κB活化的關(guān)鍵介導(dǎo)因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要推動(dòng)作用。許多研究中已經(jīng)證實(shí)c-IAP1在肝癌[7]、膀胱癌[8]、宮頸癌[9]、胃癌[10]等多種腫瘤組織中發(fā)揮了重要作用，但是c-IAP1在頭頸部腫瘤中的表達(dá)及預(yù)后報(bào)道尚少。本研究收集了手術(shù)切除且病理學(xué)診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌的60例石蠟切片，對(duì)應(yīng)癌旁正常上皮組織60例，通過免疫組化檢測(cè)c-IAP1蛋白在喉癌組織中表達(dá)陽性率為81.67%，明顯高于癌旁正常上皮組織(χ2=42，P<0.001)，結(jié)合患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，c-IAP1蛋白表達(dá)水平與吸煙、飲酒、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期具有相關(guān)性，而與年齡、性別、臨床分型無相關(guān)性。喉癌組織中caspase-3蛋白的陽性率僅為20.00%，低于其在正常癌旁組織中的陽性率(χ2=42.087，P<0.001)。在Wang Y等[11]的研究中可發(fā)現(xiàn)caspase-3的表達(dá)率在胃黏膜癌變進(jìn)展中呈下降趨勢(shì)。Sarah J.Storr等[12]發(fā)現(xiàn)Caspase-3在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織。Jayathilake AG等[13]研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3的表達(dá)在腺癌細(xì)胞中明顯低于正常細(xì)胞，表達(dá)水平與腺癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了其在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。此外，許多文獻(xiàn)也已經(jīng)證實(shí)了Caspase-3在胃癌[14]、宮頸癌[15]、皮膚惡性腫瘤[16]、前列腺癌[17]等疾病中也呈現(xiàn)低表達(dá)，發(fā)揮調(diào)控作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，caspase3蛋白表達(dá)水平與吸煙、飲酒、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期具有相關(guān)性，而與年齡、性別、臨床分型無相關(guān)性。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)c-IAP1蛋白在喉癌組織中呈高表達(dá)，而在其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中呈現(xiàn)低表達(dá)；caspase3蛋白在喉癌組織中呈低表達(dá)，而在其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中呈現(xiàn)高表達(dá)；c-IAP1蛋白與caspase3蛋白在喉癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；c-IAP1蛋白和caspase3蛋白與吸煙、飲酒、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期具有相關(guān)性，而與年齡、性別、臨床分型無相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)上述兩種蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。喉癌的發(fā)生發(fā)展是需要多因素共同作用的，是一個(gè)多階段的發(fā)展過程，c-IAPl和Caspase-3蛋白在喉癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用有可能成為喉癌治療的新靶點(diǎn)，從而提高喉癌治療效果，改善患者生存質(zhì)量。因此，進(jìn)一步深入研究c-IAP1和caspase3蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，調(diào)控兩種蛋白的表達(dá)，從而抑制喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展，可為喉鱗狀細(xì)胞癌患者的生物靶向治療提供一個(gè)初步的理論依據(jù)。