王玉霞，羅祿軍，張 賽，黃曉斐，賈廣韜，孫同毅，高媛媛

（濰坊醫(yī)學院1.藥學院，2.生命科學與技術(shù)學院，山東省蛋白質(zhì)與多肽藥物工程實驗室，山東省高校生物藥物重點實驗室，山東 濰坊 261053）

抗生素的廣泛使用甚至濫用導致耐藥性菌株種類和數(shù)量驚人地增長，已成為全球性公共衛(wèi)生安全問題[1]?？咕氖蔷哂锌咕钚缘亩嚯姆肿覽2]，相比于傳統(tǒng)抗生素，不易產(chǎn)生耐藥性，作為對抗抗生素耐藥細菌的潛在候選藥物備受關(guān)注?？咕拇嬖谟诮^大多數(shù)生命體中（包括病毒、原核微生物、真核微生物、原生生物、植物、魚類、昆蟲、兩棲類、爬行類和哺乳動物等），是生物經(jīng)過長期進化適應(yīng)外在生存環(huán)境的產(chǎn)物。組蛋白來源的抗菌肽多存在于魚類等水生生物體內(nèi)，與組蛋白氨基酸序列高度相似，在不同生命體中擁有較高的保守性[3]，因其優(yōu)良的抗菌特性成為近幾年的研究熱點[4]。

抗菌肽buforin是其中一類組蛋白來源的抗菌肽，主要包括buforin Ⅰ，buforin Ⅱ和buforin Ⅱ衍生肽。buforin Ⅰ最早由Park等[5]從亞洲蟾蜍的胃組織中分離得到，是首個被挖掘的buforin家族抗菌肽。組蛋白H2A通過在蛙胃部冗余表達并分泌到胃內(nèi)腔，經(jīng)過胃蛋白酶C的切割，形成含有39個氨基酸殘基的多肽，即buforin Ⅰ，其具有較強抗菌活性（表1），形成的抗菌層可以防止外來細菌侵襲蛙胃[6]。buforin Ⅱ是buforin Ⅰ在胞內(nèi)經(jīng)蛋白酶進一步切割后得到的含21個氨基酸殘基的多肽[7]，其抗菌活性較buforin Ⅰ有較大提高，且具有良好的抗癌活性。本文對buforin Ⅱ及其重要衍生肽的結(jié)構(gòu)及其抗菌和抗癌活性的最新研究進展進行綜述，為改造現(xiàn)有抗菌肽，開發(fā)生物活性、安全性和穩(wěn)定性更好的潛力分子及其臨床應(yīng)用提供思路。

表1 buforin及其衍生肽的抑菌活性[5，7，9]

1 buforin Ⅱ的結(jié)構(gòu)

buforin Ⅱ的氨基酸序列為TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK，含有5個精氨酸（arginine，Arg）和1個賴氨酸，帶6個正電荷。buforin Ⅱ二級結(jié)構(gòu)的分子動力學（molecular dynamics，MD）模擬結(jié)果表明，C端由兩親性α螺旋構(gòu)成，正電荷側(cè)鏈和疏水側(cè)鏈分布在螺旋的兩面。多肽主鏈上第11位氨基酸——脯氨酸處的剛性吡咯環(huán)打斷了α螺旋，形成了一個脯氨酸鉸鏈，在鉸鏈的N端形成了一個額外螺旋區(qū)[7]。buforin Ⅱ具有獨特的分子結(jié)構(gòu)，從N端到C端依次為“螺旋-脯氨酸鉸鏈-兩親性螺旋”（圖1A），此特殊結(jié)構(gòu)使其具有獨特的抗菌機制。隨著對其結(jié)構(gòu)與功能探索的深入，研究者以buforin Ⅱ為藍本設(shè)計了大量buforin Ⅱ衍生肽，對抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的研究起到了促進作用。

圖1 Buforin Ⅱ結(jié)構(gòu)（A）及其選擇性穿膜（B）、抗菌（C）、抗癌（D）機制.Arg：精氨酸；Pro：脯氨酸；Lys：賴氨酸.

2 buforin Ⅱ的抗菌作用及其機制

buforin Ⅱ的二級結(jié)構(gòu)與陽離子螺旋抗菌肽，特別是等陽離子螺旋抗菌肽（cathelicidin）家族的LL-37[8]極其相似。LL-37通過利用正電荷的氨基酸殘基（Arg/賴氨酸）靶向細菌帶負電荷的磷脂和脂多糖，通過擾動細胞膜發(fā)揮抗菌作用。但大量研究結(jié)果表明，有別于LL-37等陽離子螺旋抗菌肽家族抗菌肽，buforin Ⅱ是穿透細胞膜而非破壞細胞膜發(fā)揮作用。因此，研究buforin Ⅱ的穿膜機制有重要意義。

2.1 buforin Ⅱ的穿膜機制

脯氨酸鉸鏈和“Arg面”賦予buforin Ⅱ穿透細胞膜而不破壞細胞膜的特殊生物活性。Uyterhoeven等[9]研究表明，buforin Ⅱ一級氨基酸序列可在水溶液中形成“螺旋-脯氨酸鉸鏈-兩親性螺旋”的二級結(jié)構(gòu)，而其最重要特點是5個Arg處于一個平面，形成一個“Arg面”。這個“Arg面”帶有5個正電荷，在遇到負電荷磷脂分子時，通過電荷吸引，分子迅速反轉(zhuǎn)使“Arg面”朝向膜[10]。肽的N端和C端以脯氨酸鉸鏈為核心發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，與Arg接觸的磷脂分子迅速向內(nèi)部塌陷，形成瞬時孔道進入胞內(nèi)[11]（圖1B）。當11位脯氨酸被置換為其他氨基酸時破壞細胞膜，而非穿透細胞膜，驗證了脯氨酸鉸鏈是buforin Ⅱ穿膜而非破膜的關(guān)鍵[7，12]。

與此同時更多的數(shù)據(jù)表明，富集的Arg是穿膜肽的一個重要特征，許多穿膜肽如Tat，tachyplesin Ⅰ和bactenecin-7等均可通過在序列中富集的Arg發(fā)揮穿膜功能[13]。而buforin Ⅱ形成的“Arg面”驗證了這一觀點，為之后改造多肽和預(yù)測多肽結(jié)構(gòu)提供了理論基礎(chǔ)。此外，由于buforin Ⅱ可通過獨特的穿膜機制將藥物遞送至胞內(nèi)而未破壞細胞，在藥物遞送方面也具有潛在的應(yīng)用價值[14-16]。

2.2 buforin Ⅱ的抗菌機制

buforin Ⅱ?qū)毦℅+/G-）和真菌均有廣譜高效的抗菌能力（表1）。buforin Ⅱ?qū)追N典型的G+/G-菌均有較強的抑菌活性（最低抑菌濃度≤4 mg·L-1），且對真菌的抑菌活性（最低抑菌濃度為1 mg·L-1）強于細菌。根據(jù)buforin Ⅱ穿膜而不破膜的特殊機制，推測其抗菌靶點在胞內(nèi)。Uyterhoeven等[9]推測其胞內(nèi)靶點為帶負電的DNA，并進行了buforin Ⅱ與DNA體外MD模擬。結(jié)果表明，buforin Ⅱ與DNA的雙螺旋大溝緊密結(jié)合，且結(jié)合前后多肽構(gòu)象并未發(fā)生顯著改變（圖1C）。buforin Ⅱ各氨基酸側(cè)鏈與DNA結(jié)合時的相互作用研究結(jié)果表明，Arg2，Arg14和Arg20與DNA的相互作用能較高。借此驗證了細菌DNA可能是buforin Ⅱ的抗菌靶點之一。

郝剛課題組[17-18]對buforin Ⅱ及其衍生肽的抗菌機制做了較多研究，主要有以下結(jié)果：①buforin Ⅱ可與DNA靜電吸附結(jié)合，通過消除堿基堆砌力使雙螺旋構(gòu)型解旋達到抗菌效果；②buforin Ⅱ與DNA結(jié)合部分較為保守，AT堿基對的濃度越高，結(jié)合能力越強；③buforin Ⅱ也可與RNA結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響大分子物質(zhì)合成；④buforin Ⅱ可攻擊呼吸鏈，抑制呼吸作用和ATP合成。

目前，有關(guān)buforin Ⅱ抗菌機制方面的研究還停留在體外實驗和分子模擬的水平，雖然已經(jīng)證明buforin Ⅱ可抑制DNA的部分功能，但仍然不排除其他靶點，因此需進一步驗證。

3 buforin Ⅱ的結(jié)構(gòu)改造及其衍生肽的抗菌作用

為提高 buforin Ⅱ的抗菌能力，Park等[7]用3種策略對buforin Ⅱ進行結(jié)構(gòu)改造。第1種是截斷策略，通過逐一將氨基酸從N端或C端切下，驗證截短多肽的抗菌功能。buforin ⅡN端的4個氨基酸殘基（TRSS）被切除后，得到衍生肽buforin ⅡA，其序列為RAGLQFPVGRVHRLLRK，抗菌活性得以提升。與之相反，C端氨基酸殘基的切除會導致抗菌活性降低（最小抑菌濃度＞256 mg·L-1），且圓二色光譜圖顯示多肽呈無規(guī)卷曲。第2種改造策略是替換策略，在buforin ⅡA的基礎(chǔ)上替換個別氨基酸，這一策略同樣會導致抗菌活性的喪失。第3種是拼接策略，即用不同多肽片段與buforin核心序列進行拼接。buforin ⅡB是對α螺旋部件（RLLR）進行3次重復得到的buforin Ⅱ衍生物，其序列為RAGLQFPLGRLLRRLLRRLLR。此拼接改造增強了C端兩親螺旋的正電荷密度和疏水強度，其抗菌活性與buforin ⅡA相似甚至更高（表1）。Kim等[19]做了相似的拼接改造，并將之命名為histonin，序列為RAGLQFPVGKLLKKLLKRLKR，與 Bufouin Ⅱ相比其抗菌效果較差（表1），但增強了其在原核表達系統(tǒng)中的表達量。Beyth等[20]在buforin ⅡB的基礎(chǔ)上做了進一步改造：一方面通過增強脯氨酸附近氨基酸側(cè)鏈空間位阻來增強脯氨酸鉸鏈；另一方面將亮氨酸全部替換為疏水性更強的纈氨酸，增強脯氨酸鉸鏈兩端兩親性螺旋的疏水強度。改造得到的肽序列為RVVRQWPIGRVVRRVVRRVVR，將其命名為buforin ⅢB。buforin Ⅲ B較buforin ⅡB對大腸桿菌和糞腸球菌有更強的抑制作用。另外，肽環(huán)化也可在固定多肽構(gòu)象的基礎(chǔ)上，使抗菌活性得到提升[21]。

此外，增強抗菌肽對蛋白酶的耐受性也是重要的改造方向。Meng等[22]對buforin家族多個抗菌肽進行了氟化改造，通過將亮氨酸側(cè)鏈甲基的6個氫替換為氟，得到了多個buforin家族抗菌肽的氟化物。這些多肽對胃蛋白酶的耐受顯著增強，抗菌能力也得到了保留或加強，但溶血活性卻無改變。

4 buforin Ⅱ衍生肽的抗癌作用和機制

buforin Ⅱ抗癌作用的研究起步較晚，由于此時已發(fā)現(xiàn)作用機制相同但生物活性更強的buforin ⅡB，為此抗癌作用研究主要集中于buforin ⅡB。

Lee等[23]對buforin ⅡB的廣譜抗癌效果進行了驗證，對其對人成纖維細胞、小鼠胚胎成纖維細胞、Jurkat和HeLa細胞的細胞毒性進行了檢測。結(jié)果表明，buforin ⅡB對2種成纖維細胞株（人和小鼠的正常組織細胞）無殺傷作用，但在極低濃度對2種癌細胞的殺傷率即可＞85%。這種對癌細胞的選擇性殺傷可能是由于癌細胞膜上有大量帶負電荷的神經(jīng)節(jié)苷脂。隨后，他們測定了buforin ⅡB對包括非小細胞肺癌、白血病、乳腺癌、中樞神經(jīng)瘤、黑色素瘤、腎癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和前列腺癌在內(nèi)的62種癌細胞株的半數(shù)抑制濃度。結(jié)果顯示，半數(shù)抑制濃度均＜25 mg·L-1，表明buforin ⅡB體外有廣譜抗癌作用，同時也闡明了buforin ⅡB對癌細胞和正常細胞毒性有差異的原因。癌細胞表面有很多帶負電的神經(jīng)節(jié)苷脂，buforin ⅡB帶正電荷的“Arg面”可以神經(jīng)節(jié)苷脂為靶點富集到癌細胞表面，從而選擇性攻擊癌細胞。在選擇性進入癌細胞后，內(nèi)膜系統(tǒng)中只有線粒體表面帶有較高密度的負電磷脂，之后則通過線粒體依賴途徑來誘導癌細胞凋亡（圖1D）。

buforin ⅡB對不同癌細胞的抗癌機制或有不同。Li等[24]報道，buforin ⅡB通過調(diào)控周期蛋白依賴性激酶2和周期蛋白A的表達，阻斷肺癌細胞HepG 2的細胞周期，從而抑制癌細胞的活性。Han等[25]報道，buforin ⅡB通過P53途徑誘導前列腺癌細胞Pc-3和Du-145凋亡。buforin ⅡB在體外的廣譜抗癌能力使其成為一種新型的抗癌分子，但由于其對不同癌細胞的抗癌機制不同，因此仍有待深入研究。

表2 組蛋白H2A源抗菌肽buforin Ⅱ的同源肽

5 buforin Ⅱ同源肽與結(jié)構(gòu)改造

buforin Ⅱ為亞洲蟾蜍H2A源抗菌肽，在許多水生生物及兩棲動物中均發(fā)現(xiàn)了buforin Ⅱ的同源肽（表 2）。其中abhisin[26]來自于盤鮑，當abhisin濃度為250 mg·L-1時，不能抑制其他幾種G+/G-致病菌（如溶藻弧菌和副溶血性弧菌）的生長，但對卵形假單胞菌的生長抑制作用強于對其他幾種細菌。hipposin[27-28]來自于大西洋比目魚的皮膚黏液，對多種致病菌均具有良好的抗菌能力。與之類似的還有himantura，litopenaeu和scallop A等。這些抗菌肽均為組蛋白H2A源抗菌肽，序列上保留了脯氨酸鉸鏈，并含有大量帶正電荷氨基酸殘基。有一個例外是parasin[29]，來自于鯰魚的皮膚黏液，序列并未保留重要的脯氨酸鉸鏈，且二級結(jié)構(gòu)也與其他組蛋白H2A N端抗菌肽的α螺旋不同，而是以兩親性β折疊為特征。根據(jù)序列的保守性，Kong等[4]利用齊河鯽魚cDNA文庫和PCR技術(shù)，得到了齊河鯽魚的組蛋白H2A源抗菌肽Ca-L-hippo，其抑菌效果與hipposin相近。

這些抗菌肽是長期自然選擇保留下來的天然肽序列，對其進行活性探究對發(fā)現(xiàn)新抗菌肽和改造抗菌肽結(jié)構(gòu)方面意義重大。對不同物種同源片段的整理和分析，既可拓寬研發(fā)潛在活性多肽分子的思路，也可加深人們對多肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解，在抗生素濫用導致耐藥性嚴重的今天尤為重要。

5 結(jié)語

目前對buforin Ⅱ的研究仍集中于分子改造與作用機制方面，雖可通過各種改造得到抗菌效果良好的衍生肽，但其抗菌作用靶點尚未確定，仍需要繼續(xù)探索。buforin Ⅱ獨特的穿膜機制在納米藥物研究上有獨特優(yōu)勢，目前已有研究通過將buforin Ⅱ修飾在磁性納米粒上，利用其穿膜特性將納米制劑遞送至胞內(nèi)靶點，但這樣的修飾手段抑制了buforin Ⅱ原本的抗菌效力[16，30]。因此，在利用穿膜特性的同時如何保留其原本的抗菌活性也需繼續(xù)探索。