李海龍，張若彤，衛(wèi)怡穎，張杉杉，馬博威，李霄鶴，2，周紅剛，2

（1.南開大學藥學院，天津 300350；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300450）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性進行性疾病，最初纖維結締組織沉積，進而影響肺泡氣體交換，導致呼吸衰竭，最終死亡[1]。PF可分為原發(fā)性、藥物性、免疫性和特發(fā)性PF（idiopathic PF，IPF）等。IPF比例最高，全世界約有300萬人患有PF疾病，診斷后平均生存期2～4年[2]。到目前為止，IPF的治療藥物只有美國食品藥品管理局批準的抗纖維化藥物吡非尼酮（pirfenidone）和尼達尼布（nintedanib），且只能緩解肺功能下降，并不能逆轉已經(jīng)形成的纖維化[3]。因此迫切需要尋找新的針對該疾病的治療靶點。許多研究表明，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）參與了PF的發(fā)病機制。例如，在IPF患者的肺組織中檢測到circRNA同源域相互作用蛋白激酶3（circular homeodomain interacting protein kinase 3，circHIPK3）表達異常，提示干預circHIPK3可能是治療IPF的一種有希望的方法[4]。Yao等[5]報道，在經(jīng)二氧化硅（silicon dioxide，SiO2）處理的肺上皮細胞及小鼠PF組織中，circRNA CDR1as可以通過miR-7釋放轉化生長因子β受體2（transforming growth factor-β receptor 2，TGF-βR2），進而促進上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，在PF過程中發(fā)揮重要作用。miR-7與circRNA CDR1as之間的相互作用可能在PF中發(fā)揮重要作用，并可能是潛在的治療靶點。本綜述系統(tǒng)總結circRNA在PF病理機制中的作用及其調控機制，有助于闡明PF的發(fā)病機制及其治療。

1 環(huán)狀RNA分類與功能

circRNA由前體mRNA反向剪切形成，是一種共價閉環(huán)結構的非編碼RNA。與線性mRNA不同，circRNA不含5′端帽子和3′端多聚腺苷酸尾巴結構，不受RNA外切酶影響，不易降解，可更穩(wěn)定存在[6]。早在20世紀末circRNA即被發(fā)現(xiàn)，但最初被認為是基因剪切的副產(chǎn)物。隨著高通量測序技術發(fā)展，大量組織特異性或細胞特異性的circRNA被成功識別[7-8]。研究表明，circRNA在細胞增殖、遷移、侵襲和多能性等多種生物學功能中發(fā)揮重要作用[9]。circRNA可以作為競爭性內源性RNA或蛋白編碼RNA，或與RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBP）相互作用，廣泛參與糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和纖維化等疾病的生理和病理過程[10]。

根據(jù)母本基因的外顯子和內含子環(huán)化方式不同，circRNA有3種成環(huán)機制[11]（圖1）。① 剪切體的索尾插接調控。在前體mRNA中外顯子下游的5′端連接到上游的3′端形成索尾插接環(huán)化，然后通過剪切形成circRNA。②順式作用元件調控。一種內含子中含有反向互補序列，形成雙鏈RNA，然后通過可變剪切形成含內含子和不含內含子的circRNA；另一種是外顯子以及兩旁的內含子競爭進行RNA配對，進而通過可變剪切形成circRNA。③RBP調控。RBP結合內含子，從而促進circRNA的形成。

圖1 環(huán)狀RNA成環(huán)機制和分類.

根據(jù)包含的母本基因內含子和外顯子的不同，circRNA可分為3類[12]（圖1）。① 只有外顯子的circRNA（exonic circRNA）；② 只有內含子的circRNA（intronic circRNA）；③ 同時有外顯子和內含子的circRNA（exon-intron circRNA）。此外，circRNA還可以發(fā)揮重要的生物學功能，如剪接或轉錄、與RBP結合發(fā)揮功能、微RNA海綿作用和翻譯蛋白質等。

2 環(huán)狀RNA在肺纖維化中的調控作用

2.1 在上皮-間充質轉化中的作用

EMT是指上皮細胞失去頂基極性和細胞黏附特性通過特定的過程向間質細胞轉化的生物學過程[13]。TGF-β1/Smad經(jīng)典信號通路在參與肺泡上皮細胞EMT的激活中起著主導作用[14]。在纖維化過程中，EMT誘導信號的持續(xù)，產(chǎn)生細胞外基質積累，導致組織重塑和器官病理變化。然而，EMT在IPF發(fā)生中的作用存在爭議。Jason等[15]研究報道，在博來霉素誘導的小鼠PF模型中跟蹤肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT-Ⅱ細胞）的命運，發(fā)現(xiàn)標記的AT-Ⅱ細胞未轉變?yōu)榧〕衫w維細胞。然而，IPF來源的間充質細胞常被發(fā)現(xiàn)共同表達上皮和間充質標志物，因此，這表明IPF來源間充質細胞是上皮細胞經(jīng)過EMT轉化生成的[16]。雖然IPF的具體發(fā)病機制尚不完全清楚，但目前大多數(shù)研究認為，在一定程度上EMT是存在的。

Yao等[5]報道，miR-7可以通過阻斷人支氣管上皮細胞（human bronchial epithelial cells，HBE）和人肺癌細胞A549的EMT進程而發(fā)揮其抗PF的作用。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，circRNA CDR1as與miR-7有多個結合位點。circRNA CDR1as可抑制miR-7對EMT及其靶標TGF-βR2的抑制作用，從而導致PF。

Fang等[17]報道，SiO2誘導的細胞增殖、遷移和標志物水平的改變可通過靶向circHECTD1的小干擾RNA恢復，也可通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)使HECTD1過表達，證實circHECTD1/HECTD1通路參與內皮細胞-間充質轉化（endothelial-mesenchymal transition）。該研究發(fā)現(xiàn)，circHECTD1/d1可能與潛在硅肺患者PF發(fā)生有關。Jiang等[18]報道，circZC3H4作為miR-212海綿調控ZC3H4表達，在EMT中發(fā)揮關鍵作用。在肺纖維化模型小鼠和IPF患者肺泡上皮細胞中ZC3H4表達上調。

2.2 在成纖維細胞激活和肌成纖維細胞活化中的作用

肺組織中由肌成纖維細胞和細胞外基質蛋白異常表達組成的纖維化灶的形成是IPF的一個顯著的病理特征。研究表明，肌成纖維細胞是最終導致嚴重纖維化過程的細胞[19-20]。肺肌成纖維細胞的累積主要來自于肺組織的成纖維細胞。因此，了解成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化（fibroblast-to-myofibroblast transition，F(xiàn)MT）過程在IPF中的發(fā)生，可能會成為預防IPF進展的有效手段。

Zhang等[4]報道，circHIPK3在IPF患者肺組織中表達異常，且在博來霉素誘導的PF模型小鼠和FMT的肌成纖維細胞中表達升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3沉默可以改善FMT并抑制成纖維細胞在體內外增殖。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在IPF模型小鼠和FMT衍生的肌成纖維細胞中，circ0044226升高，而miR-7降低。circ0044226作為內源性miR-7海綿可以改善FMT，抑制成纖維細胞的活力和增殖。circ0044226的介入治療可能是一種很有前途的治療PF方法[21]。Chu等[22]研究報道，在HPF-α細胞中過表達circHECTD1或敲除HECTD1可逆轉SiO2誘導的細胞自噬，進而恢復SiO2誘導的成纖維細胞活化、增殖和遷移。

2.3 對巨噬細胞的調控作用

巨噬細胞在組織纖維生成中起關鍵作用，是許多終末期慢性炎癥性疾病發(fā)病機制的基礎[23]。在許多慢性炎癥性疾病中，纖維化是進行性器官衰竭的原因。巨噬細胞是纖維發(fā)生的主要驅動力，并與產(chǎn)生膠原的肌成纖維細胞非常接近。它們產(chǎn)生可直接激活成纖維細胞的纖維變性因子，如TGF-β1和血小板衍生因子，并通過調節(jié)各種基質金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶組織抑制劑的平衡來控制細胞外基質更新[24]。巨噬細胞還可通過分泌募集成纖維細胞和其他炎癥細胞的趨化因子來調節(jié)纖維生成。SiO2刺激肺泡上皮細胞發(fā)生炎癥反應，進而導致成纖維細胞增殖引起纖維化。Zhou等[25]報道，circHECTD1和HECTD1可通過泛素化參與SiO2誘導的巨噬細胞活化，進而促進成纖維細胞增殖和遷移。該研究為硅肺治療提供了新思路。

Yang等[26]報道，巨噬細胞在PF中具有重要作用，circRNA在SiO2誘導的肺巨噬細胞炎癥中也發(fā)揮重要作用。他們采用健康供體和患者肺泡巨噬細胞原代培養(yǎng)及RAW264.7巨噬細胞系，探討circ-ZC3H4在巨噬細胞活化中的作用。研究結果表明，circZC3H4和ZC3H4蛋白參與了SiO2誘導的巨噬細胞活化并且可促進成纖維細胞增殖和遷移。在硅肺患者的組織樣本中發(fā)現(xiàn)ZC3H4蛋白表達增強。該結果闡明了SiO2誘導的巨噬細胞活化與circ-ZC3H4/ZC3H4途徑之間的關系，從而為應用ZC3H4開發(fā)新的硅肺治療策略提供了新思路。

2.4 在轉化生長因子β信號通路中的作用

過去20年來，纖維化發(fā)生對TGF-β活性的依賴性一直是研究的重點[27-28]。TGF-β相關信號通路在細胞增殖、分化、遷移、細胞外基質沉積及上皮細胞損傷后修復等方面具有重要作用。其中，TGF-β1在IPF中至關重要[29]，是目前公認的最重要的促纖維化信號。在IPF疾病進展過程中，TGF-β1可活化炎癥細胞，介導肺泡EMT，促進成纖維化細胞增殖分化和刺激細胞外基質沉積等，在PF發(fā)病過程中起著重要的中心調控作用。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過調節(jié)TGF-β1/Smad信號通路調節(jié)PF進程。Lindsay等[30]揭示了miR-1343在減弱肺上皮細胞系和原代成纖維細胞中TGF-β信號傳導中的作用。MiR-9-5p可靶向TGF-βR2和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷氧化酶4調節(jié)PF等[31]。然而關于circRNA通過TGF-β相關信號通路調節(jié)IPF的研究知之甚少。Yang等[32]對博來霉素誘導的PF大鼠肺組織進行了RNA-seq，探索了潛在的與PF相關的circRNA和基因。進一步通過基因本體（gene ontology，GO）和全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，揭示circRNA在PF中的關鍵功能和通路。GO分析證實，差異表達的circRNA在細胞成分、分子功能和生物學過程中明顯聚集。在KEGG分析中，circRNA的富集途徑有抗原處理和表達、吞噬體、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路、Ⅰ型人類嗜T細胞病毒感染和單純皰疹病毒感染等。對PF大鼠模型進行驗證后發(fā)現(xiàn)，其中5個circRNA與預測的趨勢相對一致，與PF密切相關；并且發(fā)現(xiàn)chr9：113534327|11354 6234，chr20：14319170|14326 640和chr10：5763 4023|57634588可能通過調節(jié)易位相關的Notch同源基因（notch homolog 1，translocation-associated，Notch1）和TGF-β相關信號通路參與PF進程，但上述結果仍需進一步實驗驗證。Yao等[5]報道，SiO2可誘導環(huán)狀RNA小腦變性相關蛋白1轉錄物的反義物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，circRNA CDR1as）使miR-7海綿釋放TGF-βR2，在PF中通過促進EMT發(fā)揮重要作用。該結果表明，miR-7和circRNA CDR1as之間的相互作用可能發(fā)揮重要功能，并為PF提供潛在的治療靶點。

2.5 其他機制

內質網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是一種維持蛋白質穩(wěn)態(tài)的特殊細胞器。ER主要用于蛋白質折疊和蛋白質到達胞內或胞外目的地前的質量控制[33]。ER應激是由各種應激刺激引起的缺血再灌注損傷、氧化應激和鈣穩(wěn)態(tài)失衡[34]，是許多疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，包括神經(jīng)退行性變、糖尿病、癌癥、代謝性疾病和IPF等[35]。自噬可以減輕細胞應激的影響，將受損或處理不當?shù)牡鞍踪|和細胞器運送到溶酶體進行降解，從而為代謝提供能量[36]。自噬抑制與肌成纖維細胞表型轉化有關，自噬標志物在IPF患者的全肺細胞中明顯降低[37]。Cheng等[38]報道，circ-012091調控的 P53凋亡刺激蛋白PPP1R13B通過ER應激和自噬促進肺成纖維細胞的增殖和遷移，在硅肺PF的發(fā)病過程中起著至關重要的作用。Cao等[39]還發(fā)現(xiàn)，SiO2誘導ER應激與sigma-1受體表達增強有關，而circHIPK2參與了sigma-1受體在人肺成纖維細胞中的調控。該研究闡明了SiO2誘導的纖維化與sigma-1受體信號轉導之間的聯(lián)系，從而為研究sigma-1受體/ER應激在硅肺治療潛在應用提供了新見解。

3 環(huán)狀RNA在肺纖維化診斷治療中的作用

circRNA是近年來RNA研究領域的一個熱點，是某些疾病的潛在治療靶點和診斷性生物標志物。Li等[40]通過circRNA表達譜芯片在IPF患者的血漿中識別出67個嚴重失調的circRNA，其中38個上調，29個下調。進一步驗證表明，與健康對照組相比，IPF患者的血漿樣本中（hsa）_circRNA_100906，hsa_circRNA_102100和 hsa_circRNA_102348均顯著升高，hsa_circRNA_101225，hsa_circRNA_104780和hsa_circRNA_101242表達降低。此外，熒光素酶報告基因分析證實，hsa_circRNA_100906和hsa_circRNA_102348分別與miR-324-5p和miR-630直接相互作用，提示在IPF患者肺組織中miR-324-5p和miR-630降低。上述結果表明，hsa_circRNA_100906和hsa_circRNA_102348及其相關通路可能成為IPF新的臨床標志物和治療靶點。

4 結語

circRNA是非編碼RNA的一種，可通過多種機制調控基因表達，參與多種細胞分化和生物發(fā)育過程。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在IPF中發(fā)揮重要作用，然而其作用機制仍未完全闡明。綜上所述，circRNA與IPF發(fā)病密切相關，包括調節(jié)EMT、FMT、巨噬細胞、TGF-β、ER應激和自噬等，然而其在IPF中的上皮細胞修復、細胞衰老、膠原沉積以及Smad和non-Smad通路的調控作用未見報道。目前的研究也主要集中于生理和病理過程中其表達的變化。circRNA不受RNA外切酶影響，不易降解，故被作為多種疾病診斷和治療的生物標志物，如circRNA 100906和circRNA 102348已被鑒定為IPF的生物標志物，但仍需更多的工作來探索它們在PF臨床上的作用。目前已發(fā)現(xiàn)大量circRNA與PF有關，但仍處于初步研究階段。未來circRNA可能會成為基因調控的重要參與者，探索circRNA在診斷PF和基因治療具有重要意義。