秦少博，黃增剛

(1.西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710002；2.安康市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，陜西 安康 725000)

心肌缺血/再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是指心肌組織缺血后恢復(fù)血流灌注而發(fā)生的心肌組織損傷加重甚至出現(xiàn)不可逆性損傷的病理過(guò)程，可加重心功能障礙和心肌結(jié)構(gòu)的破壞，嚴(yán)重威脅患者的生命健康安全[1]。MIRI的發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前研究[2-3]認(rèn)為其病理生理過(guò)程涉及氧自由基增多、炎性細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)、鈣超載和能量代謝障礙等，故目前臨床防治MIRI主要通過(guò)抑制炎性反應(yīng)、抗氧化、減輕鈣超載和能量代謝障礙以及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等途徑[4]。纈沙坦/氨氯地平為血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin receptor blockers,ARBs)纈沙坦與鈣通道阻滯劑(Calcium channel blockers,CCBs)氨氯地平的復(fù)方制劑，臨床廣泛應(yīng)用于原發(fā)性高血壓的治療。臨床實(shí)驗(yàn)[5]表明，ARBs具有抗炎、抗心肌細(xì)胞凋亡、抗動(dòng)脈粥樣硬化和對(duì)抗梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)等作用，已逐步成為各類心血管疾病的常用治療藥物之一。CCBs具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能和中性粒細(xì)胞聚集的作用，并可通過(guò)阻斷鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，改善鈣超載[6]。既往研究[7]還發(fā)現(xiàn)，ARBs和CCBs類藥物除發(fā)揮降壓作用，具有獨(dú)立于該作用之外改善心率變異性、逆轉(zhuǎn)左心室肥厚、縮短動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等靶器官保護(hù)作用，對(duì)存在靶器官損傷的高血壓患者療效更好。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的短鏈內(nèi)源性非編碼RNA，成熟的miRNA可與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)(3’-Untranslated regions,3’-UTR)相結(jié)合，沉默或降解靶基因，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化和凋亡過(guò)程中均起重要作用[8]。已有多項(xiàng)研究[9-10]認(rèn)為，miR-21參與了多種心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，通過(guò)細(xì)胞凋亡和自噬途徑，調(diào)控心律失常、心肌肥厚、心肌細(xì)胞損傷等多個(gè)生理病理過(guò)程。然而，纈沙坦/氨氯地平對(duì)MIRI有無(wú)療效、miR-21是否參與了MIRI的病程、其具體分子機(jī)制如何，目前鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)給予MIRI模型大鼠纈沙坦/氨氯地平，觀察其對(duì)大鼠心肌組織的保護(hù)作用，并探究其可能的作用機(jī)制，以期為臨床治療MIRI提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康雄性SPF級(jí)SD大鼠30只，8周齡，體重(180±10)g，西安微元生物醫(yī)藥研究所有限公司，許可證號(hào)：SYXK(陜)2020-006，常規(guī)飼養(yǎng)于潔凈動(dòng)物房?jī)?nèi)，恒溫恒濕，正常晝夜交替，自由攝食攝水。

1.1.2 藥品及試劑：纈沙坦/氨氯地平片(80 mg/5 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字J20150135)；注射用青霉素鈉80萬(wàn)U(國(guó)藥準(zhǔn)字H20033934)；水合氯醛、DMSO、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT(美國(guó)Gibco)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒、Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)；抗過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)抗體、核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor 1,NRF1)抗體、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)抗體(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.3 主要儀器：超低溫冰箱、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；電子天平(瑞士METTLERTOLEDO公司)；石蠟組織切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；激光共聚焦顯微鏡(尼康儀器有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；紫外分光光度儀(日本島津公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及MIRI模型建立：將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組均建立MIRI模型：腹腔注射10%水合氯醛溶液，待麻醉效果滿意后固定大鼠于手術(shù)臺(tái)上，氣管插管接呼吸機(jī)輔助呼吸，胸部備皮，碘伏常規(guī)消毒，胸腔正中切1.5～2 cm切口，剪開心包，用無(wú)損傷線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，剪斷扎線，恢復(fù)血流灌注，建立MIRI模型。假手術(shù)組僅開胸，不結(jié)扎。術(shù)后腹腔注射80萬(wàn)U/d青霉素預(yù)防感染，連續(xù)注射3 d。灌胃給予治療組30 mg/kg的纈沙坦/氨氯地平藥物混懸液，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水，共連續(xù)給藥8周。

1.2.2 取樣及處理：治療結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，碘伏消毒，打開胸腔，斷開肋骨，取出整個(gè)心臟，分離左心室，冰冷的無(wú)菌PBS洗滌，立即稱重后置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察：取各組部分心肌組織，10%甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切5 μm厚連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 心肌梗死面積比例：取各組部分心肌組織病理切片，稱重，沿白色心肌梗死區(qū)域邊緣切下梗死心肌組織，稱重，計(jì)算梗死心肌占總心肌的比例。

1.2.5 心肌細(xì)胞生存率：取各組部分心肌組織，剪碎，勻漿，RIPA裂解液裂解消化，用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)至第三代，用PBS調(diào)整細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)為1×106個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，每組各設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后吸棄上清，加入DMSO溶解結(jié)晶，震蕩10 min，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(OD)。

1.2.6 各組心肌組織中miR-21和PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)：分別取各組心肌組織，稱重，冰冷水浴中剪碎、研磨，采用Trizol試劑提取各組中的總RNA，于260 nm和280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A，計(jì)算純度和濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s、65 ℃退火延伸15 s共38個(gè)循環(huán)。以u(píng)6作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算各組中miR-21和PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 模型組大鼠心肌組織可見心肌纖維和間質(zhì)壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，心肌纖維化，嗜酸性粒細(xì)胞增強(qiáng)，大量心肌細(xì)胞核呈現(xiàn)碎裂或變性狀。治療組心肌組織形態(tài)基本趨于正常，心肌纖維基本排列整齊，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫明顯改善，心肌細(xì)胞胞漿染色較為均勻。假手術(shù)組大鼠心肌組織基本正常，可見極少量炎性浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞形態(tài)正常。見圖1。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：治療組

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比例比較 三組大鼠心肌梗死面積比例相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌梗死面積比例顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)；治療組心肌梗死面積比例顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死面積比例比較(%)

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞生存率比較 三組大鼠心肌細(xì)胞生存率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=516.857,P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌細(xì)胞生存率顯著低于假手術(shù)組(均P<0.05)；治療組心肌細(xì)胞生存率顯著高于模型組(P<0.05)。見圖2。

2.4 各組大鼠心肌組織中miR-21相對(duì)表達(dá)比較 三組心肌組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=78.375,P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(均P<0.05)；治療組心肌組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)顯著低于模型組(P<0.05)。見圖3。

2.5 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA表達(dá)比較 三組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)；三組之間兩兩相比，模型組心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(均P<0.05)；治療組心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)顯著高于模型組(P<0.05)。見表3。

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

表3 各組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1、TFAM mRNA表達(dá)比較

3 討 論

缺血性心臟病目前已成為威脅人類生命健康的主要心血管疾病之一，盡快恢復(fù)缺血區(qū)血流灌注為最主要的治療方法，然而，MIRI為臨床治療缺血性心臟病過(guò)程中最常見的病理?yè)p傷之一，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)心肌梗死面積擴(kuò)大、心功能下降、心律失常甚至猝死，嚴(yán)重影響缺血性心臟病患者的預(yù)后和生命安全[11]。

既往研究[12]認(rèn)為，MIRI可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell,EC)功能障礙有關(guān)，EC釋放的一氧化氮(Nitric oxide,NO)在心血管生理病理進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，冠脈血管內(nèi)皮源性NO釋放的減少可能是EC功能障礙發(fā)生的主要早期事件。氨氯地平、硝苯地平、拉西地平等CCBs類藥物與血管內(nèi)皮依賴性舒張功能密切相關(guān)，可通過(guò)調(diào)節(jié)NO活性、促進(jìn)NO的釋放而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用；此外，CCBs還可阻礙心肌組織和血管平滑肌的鈣離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制鈣離子內(nèi)流，改善鈣超載[13]。Guo等[14]在高膽固醇血癥模型大鼠的體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺血期給予氨氯地平可顯著上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、下調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase， iNOS)，下調(diào)灌注早期NOS和iNOS的表達(dá)水平，糾正血管EC功能失調(diào)，從而發(fā)揮保護(hù)缺血缺氧心肌的作用。纈沙坦作為ARBs的代表藥物，具有降血壓，逆轉(zhuǎn)血管重塑和左心室，保護(hù)腎功能，預(yù)防心力衰竭、心肌梗死后心臟和血管的重構(gòu)等作用，已成為眾多心血管疾病的常用藥物之一?；A(chǔ)研究[15]表明，在心肌缺血/再灌注過(guò)程中，心肌組織和血液循環(huán)中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)被激活，心肌組織和血液中的AngⅡ大量釋放，其可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，增加能量消耗，降低NOS的活性，從而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞。而ARBs可選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性的與血管緊張素Ⅱ1型受體(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1)結(jié)合，從而阻滯AngⅡ所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞，減小心肌梗死面積。除此之外，ARBs可借助于其結(jié)構(gòu)中的酚醛基團(tuán)發(fā)揮清除自由基的功能，從而起到抗炎作用[16]。

本研究中，HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠心肌組織可見心肌纖維和間質(zhì)壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫明顯，嗜酸性粒細(xì)胞增強(qiáng)，大量心肌細(xì)胞核呈現(xiàn)碎裂或變性狀，而治療組大鼠心肌組織的上述表現(xiàn)明顯改善，心肌形態(tài)趨于正常，僅可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫；比較各組大鼠心肌梗死面積，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌梗死面積比例顯著高于假手術(shù)組，而治療組的心肌梗死面積比例較模型組顯著降低；此外，模型組大鼠心肌細(xì)胞生存率顯著低于假手術(shù)組，而治療組的心肌細(xì)胞生存率顯著高于模型組，上述結(jié)果均提示纈沙坦/氨氯地平可顯著改善MIRI模型大鼠心肌組織的病理?yè)p傷，減少心肌梗死面積以及MIRI引起的心肌細(xì)胞凋亡。

miRNA是一類長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸的高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，是真核生物體內(nèi)重要的調(diào)控基因表達(dá)的分子，可通過(guò)沉默靶基因，影響翻譯過(guò)程，從而抑制蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、壞死及自噬等等諸多方面產(chǎn)生巨大的影響[17]。MIRI是一種涉及心肌細(xì)胞凋亡、壞死、自噬等復(fù)雜的病理生理過(guò)程，往往伴隨著多種miRNA的異常表達(dá)。miR-21作為一種廣泛存在于機(jī)體組織器官中且靶基因眾多的miRNA，近年來(lái)的不斷深入研究[18-19]表明，其在急性冠脈綜合征、心力衰竭、高氧性急性肺損傷(Hyperoxi induced acute lung iniury,HALI)、心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、MIRI、肝臟和腎臟缺血再灌注損傷等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中均呈現(xiàn)異常表達(dá)。李童等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MIRI模型大鼠心肌組織中miR-21、miR-126的表達(dá)顯著上調(diào)。Olson等[21]的研究表明，miR-21可通過(guò)作用于靶基因PDCD4來(lái)調(diào)控缺血/再灌注損傷及心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果同樣顯示，模型組大鼠心肌組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，提示miR-21可能參與了MIRI的病理進(jìn)程；而經(jīng)纈沙坦/氨氯地平治療后，治療組大鼠心肌組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)顯著降低，提示纈沙坦/氨氯地平可通過(guò)調(diào)控miR-21的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)MIRI大鼠心肌的保護(hù)作用。

進(jìn)一步的機(jī)制通路研究發(fā)現(xiàn)，MIRI模型大鼠心肌組織中的miR-21的下游關(guān)鍵基因PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)均顯著低于假手術(shù)組；而經(jīng)纈沙坦/氨氯地平治療后，治療組大鼠心肌組織中PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)顯著升高。PGC-1α為氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)及脂肪酸氧化的最主要轉(zhuǎn)錄因子之一，可通過(guò)影響線粒體的生物合成和生理功能，并同時(shí)輔助活化NFR1和NFR2，提高心肌細(xì)胞在環(huán)境變化時(shí)對(duì)能量需求的變化[22]。Tran等[23]通過(guò)敲除小鼠的PGC-1α基因，發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟對(duì)缺血的耐受力明顯減弱，小鼠腎功能與PGC-1α的表達(dá)呈正相關(guān)。NRF1可通過(guò)調(diào)節(jié)核基因組編碼呼吸鏈亞基的表達(dá)和調(diào)控TFAM的途徑影響基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯等[24]。TFAM可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體DNA(mitochondria NDA,mtDNA)的輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[25]。本研究結(jié)果提示miR-21及其下游基因可能參與了MIRI的調(diào)控，而通過(guò)上調(diào)PGC-1α、NRF1和TFAM mRNA的相對(duì)表達(dá)可對(duì)MIRI大鼠的心肌組織發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，纈沙坦/氨氯地平對(duì)MIRI 模型大鼠的心肌組織具有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-21的表達(dá)而上調(diào)其下游基因基因PGC-1α、NRF1和TFAM的表達(dá)有關(guān)，對(duì)miR-21表達(dá)的調(diào)控有望成為臨床治療MIRI的新靶點(diǎn)之一。