康 睿，張亞瓊

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 延安 716000；2.榆林市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 榆林 719000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是臨床常見的一種以氣流受限為主要特征的呼吸系統(tǒng)疾病，該病氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，同時(shí)可伴有氣道高反應(yīng)性，患者多表現(xiàn)為肺功能減退，嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)、勞動(dòng)能力和生活質(zhì)量[1]。COPD好發(fā)于老年群體和慢性支氣管炎、肺氣腫等肺部疾病患者群體中，近年來由于人口老齡化、環(huán)境污染等問題造成我國COPD發(fā)病率和病死率不斷增加[2]。大量流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，氣道炎癥、氣道黏液高分泌與COPD發(fā)病密切相關(guān)，且持續(xù)性的氣道黏液高分泌是造成COPD高發(fā)病率和患者死亡的獨(dú)立因素[3-4]。阿比多爾是廣譜非核苷類抗病毒藥物，目前在甲型、乙型流感病毒感染[5]、新型冠狀病毒肺炎[6]治療中具有良好的效果，在流行性感冒誘發(fā)的COPD急性加重期[7]治療也能顯著提高療效。本研究以煙熏和氣管內(nèi)注射脂多糖法建立的COPD大鼠模型作為研究對象，探討了阿比多爾對COPD大鼠肺功能、氣道炎癥和氣道黏液高分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：45只SPF級雄性健康SD大鼠，10～12周齡，體重315～330 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK(渝)2018-0003。飼養(yǎng)環(huán)境條件：溫度 25 ℃，相對濕度 40%～70%，光照強(qiáng)度 15～20 Lux，自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 試劑與儀器：鹽酸阿比多爾片(0.1 g/粒，國藥準(zhǔn)字H20103373)；脂多糖(美國Sigma)；猴王磨砂香煙(烤煙型，焦油量13 mg，煙堿量1.2 mg，一氧化碳量 14 mg，陜西中煙工業(yè)公司)；水合氯醛(西亞試劑)；腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、IL-17 ELISA試劑盒(合肥萊爾)；黏蛋白5AC(MUC5AC)和鈣離子激活的氯離子通道1(CLCA1)和Toll 樣受體4蛋白(TLR4)等兔抗大鼠單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；BCA試劑盒、蛋白質(zhì)Marker購自美國Thermo Fisher公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自德國Millipore公司；RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天)；組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒、Quanti Nova SYBR Green PCR試劑盒(德國QIAGEN)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；MUC5AC、CLCA1和TLR4引物合成由上海生工生物工程有限公司提供服務(wù)。60 cm×50 cm×40 cm熏煙箱(自制)；Ani Res2005動(dòng)物肺功能測定儀(北京貝蘭博科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；普通PCR儀、電泳儀、Chemi DOC XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；R3510離心機(jī)及移液器(美國Eppendorf公司)；7500熒光定量PCR儀(美國ABI)；RT-6100型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理：將大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和阿比多爾組，各15例。模型組和阿比多爾組均采用煙熏和氣管內(nèi)注射脂多糖法[8]建立COPD模型，具體操作：建模第1天和第14天采用腹腔注射6%水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)氣管注入200 μg/200 μl脂多糖溶液，并在第2～13天、第15～28天每天上午將大鼠置入熏煙箱內(nèi)，每次持續(xù)吸入15支香煙，每天吸煙1次，每次30 min。造模成功1周后，給予阿比多爾組大鼠3 g/L阿比多爾溶液 1 ml/100 g灌胃；對照組和模型組用生理鹽水1 ml/100 g灌胃，三組連續(xù)灌胃10 d。

1.2.2 肺功能測試：在灌藥治療1周后，麻醉各組大鼠并固定，切開頸部皮膚，充分暴露氣管并插管，使用Ani Res 2005動(dòng)物肺功能測定儀測定肺活量(FVC)、呼氣峰值流速(PEF)、第0.1 s用力乎其容積(FEV0.1)、氣道阻力(RI)等肺功能指標(biāo)。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗及炎性因子測定：肺功能測試結(jié)束后，在大鼠仍在麻醉狀態(tài)下迅速打開胸腔，血管鉗結(jié)扎左支氣管，將灌胃針頭插入器官后注射4 ml生理鹽水灌洗右肺，反復(fù)灌洗3次，回收灌洗液。在4 ℃ 條件下3000 r/min離心灌洗液10 min，吸取上清液保存在-80 ℃冰箱待測。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測灌洗液上清液中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、IL-17水平。

1.2.4 Western blot法檢測肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4表達(dá)：取50～100 mg腦組織，冰上稱重后放入EP管中，加入1 ml 預(yù)冷的RIPA裂解液(帶PMSF溶液)，4 ℃用玻璃勻漿器充分勻漿處理至95%的細(xì)胞被破碎，冰浴放置10 min，每隔5 min在漩渦混合儀上振蕩30 s。在4 ℃下12000 g離心10 min，留取上清液即為組織總蛋白產(chǎn)物。采用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。根據(jù)總蛋白濃度取適量上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 V電泳30 min后轉(zhuǎn)為120 V繼續(xù)電泳60 min，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以蛋白Marker作為參照，按照目標(biāo)蛋白分子量大小切取條帶，分別加入MUC5AC、CLCA1和TLR4一抗，2 ℃過夜孵育。5%脫脂奶粉封閉1 h后加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯色并曝光。采用Image J圖像分析系統(tǒng)，以管家基因蛋白β-actin作為參比計(jì)算相對吸光度值。

1.2.5 熒光定量PCR技術(shù)檢測肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4表達(dá)：取適量肺組織，用生理鹽水沖洗血跡，冰上稱重后放入EP管中，加入1 ml 預(yù)冷的RIPA裂解液(帶PMSF溶液)，4 ℃用玻璃勻漿器充分勻漿處理至95%的細(xì)胞被破碎，冰浴放置10 min，每隔5 min在漩渦混合儀上振蕩30 s。使用組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取總RNA。以總RNA為模板采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，以cDNA為模板采用Quanti Nova SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以β-actin作為參比基因，采用2-△△CT相對定量法計(jì)算肺組織中MUC5AC、CLCA1和TLR4表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠FVC、PEF、FEV0.1及RI比較 三組大鼠FVC、PEF、FEV0.1和RI等肺功能指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。阿比多爾組大鼠FVC、PEF、FEV0.1均顯著高于模型組，但顯著低于對照組；RI顯著低于模型組，但顯著高于對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠FVC、PEF、FEV0.1及RI比較

2.2 三組大鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平比較 三組大鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17等炎性因子指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。阿比多爾組大鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平均顯著高于對照組，但顯著低于模型組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平比較(ng/L)

2.3 Western blot檢測三組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4結(jié)果比較 三組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4 蛋白相對吸光值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。阿比多爾組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4 蛋白相對吸光值均顯著低于模型組，但顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3(圖1)。

表3 Western blot檢測三組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4表達(dá)相對吸光值比較

圖1 Western blot檢測三組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4表達(dá)情況

2.4 三組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相對表達(dá)量比較 三組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。阿比多爾組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相對表達(dá)量均顯著低于模型組，但顯著高于對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠肺組織MUC5AC、CLCA1和TLR4 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

煙熏聯(lián)合氣管注射脂多糖溶液是目前制備COPD模型動(dòng)物的常用方法，既能模擬人類吸煙造成的呼吸道損害，誘發(fā)氣道炎癥，氣道黏液分泌增加；還能模擬細(xì)菌感染引起的炎癥、咳痰喘和肺功能降低等表現(xiàn)[8]。而且這種聯(lián)合制備COPD動(dòng)物模型造模時(shí)間短，4周左右即可完成造模，操作簡單，對大鼠損傷較小，建模成功率和存活率均較高[9]。本研究通過此法建立COPD大鼠模型，且發(fā)現(xiàn)模型組大鼠FVC、PEF、FEV0.1顯著低于對照組，RI和支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8、IL-17水平顯著高于對照組，提示建模成功，模型組大鼠存在明顯的肺功能降低和氣道炎癥反應(yīng)。

COPD表現(xiàn)為氣道慢性炎癥改變， COPD患者支氣管肺泡灌洗液、血清等樣本中的TNF-α、IL-8水平均顯著增加，且急性加重期患者血清TNF-α、IL-8水平增加更為明顯，目前臨床已經(jīng)將其作為評估COPD嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[10-11]。IL-17是由CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的一種炎性因子，能夠促進(jìn)TNF-α、IL-8表達(dá)和釋放，造成氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集，進(jìn)而形成氣道炎癥[12]。阿比多爾除了能夠通過降低病毒與宿主細(xì)胞融合概率阻斷病毒感染外，還能夠刺激體液免疫和細(xì)胞免疫，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，阿比多爾能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，平衡外周血CD4+、CD8+等T淋巴細(xì)胞比例，在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中具有重要作用[13]。同時(shí)阿比多爾還能誘導(dǎo)干擾素并激活吞噬細(xì)胞的作用，可有效減少肺部疾病惡化和炎癥反應(yīng)加劇[14]。本次研究中，阿比多爾組大鼠支氣管肺泡灌洗液TNF-α、IL-8、IL-17水平雖然顯著高于對照組，但顯著低于模型組，這可能是由于阿比多爾能夠改善T淋巴細(xì)胞比例，進(jìn)而下調(diào)IL-17表達(dá)，降低TNF-α、IL-8等炎癥因子水平，緩解了氣道炎癥。

COPD的另一個(gè)主要特征是氣道黏液高分泌，且氣道炎癥與氣道黏液高分泌相互促進(jìn)。氣道內(nèi)過度分泌的黏液將嚴(yán)重?fù)p害纖毛清除功能和防御功能，加重氣道阻塞，患者不能有效清除吸入的細(xì)菌、病毒，這給病原菌定制提供有利的條件，造成持續(xù)性、反復(fù)性感染，進(jìn)一步加重黏液高分泌[15]。COPD發(fā)病早期即可存在氣道黏液過度分泌，臨床主要表現(xiàn)為痰多、咳嗽。MUC5AC由杯狀上皮細(xì)胞分泌，是氣道黏液的最主要成分，對于氣道黏液彈性和黏附特性有重要作用，也是機(jī)體抵抗外來刺激、異物侵入的重要防御成分[16]。TNF-α、IL-1β等促炎因子，細(xì)菌毒性產(chǎn)物如內(nèi)毒素，吸煙等均可促進(jìn)MUC5AC表達(dá)，模型制備中脂多糖模擬細(xì)菌內(nèi)毒素，加之香煙煙熏促使大鼠形成氣道黏液高分泌。CLCA是參與杯狀細(xì)胞化生的關(guān)鍵信號分子，其表達(dá)上調(diào)可引起氣道黏液高分泌，且有報(bào)道發(fā)現(xiàn)通過抑制CLCA1能夠有效抑制黏蛋白(MUC)基因表達(dá)和黏液產(chǎn)生，并發(fā)現(xiàn)COPD患者CLCA1存在表達(dá)增強(qiáng)現(xiàn)象[17-18]。TLR4是一種病原分子識別受體，能夠與內(nèi)毒素、脂多糖結(jié)合并激活Toll樣受體，進(jìn)而激活核因子κB信號通路，促進(jìn)炎性因子表達(dá)和釋放[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)COPD患者肺組織、支氣管肺泡灌洗液中TLR4呈明顯高表達(dá)狀態(tài)[20]。本次研究采用Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種技術(shù)對大鼠肺組織中MUC5AC、CLCA1、TLR4表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果均表明，阿比多爾組和模型組MUC5AC、CLCA1、TLR4表達(dá)水平均顯著高于對照組，提示經(jīng)過煙熏和內(nèi)毒素處理后大鼠形成了明顯的氣道黏液高分泌；而阿比多爾組大鼠MUC5AC、CLCA1、TLR4表達(dá)水平均顯著低于模型組，則提示阿比多爾能夠顯著改善氣道黏液高分泌。在改善氣道炎癥和氣道黏液高分泌下，阿比多爾組大鼠FVC、PEF、FEV0.1均顯著高于模型組，說明阿比多爾能夠顯著改善COPD模型大鼠肺功能。

綜上所述，阿比多爾能夠顯著改善COPD大鼠肺功能，這與阿比多爾能夠顯著緩解氣道炎癥和氣道黏液高分泌有關(guān)，這也為阿比多爾在COPD治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。