樊 力，馮 亮

(陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院手足外科，陜西 咸陽 712000)

足底是機(jī)體重要的組織器官之一，包括足跟、足外側(cè)部分、跖趾關(guān)節(jié)，具有吸收震蕩、負(fù)重、行走等多種功能[1]。足底損傷形成創(chuàng)面是臨床外科的常見病和多發(fā)病，伴功能障礙、疼痛、感染等多種并發(fā)癥，也嚴(yán)重影響機(jī)體的身心健康。足底創(chuàng)面修復(fù)除了要注重耐磨、耐壓外，尤其需要重視足底的觸覺功能恢復(fù)，為此在修復(fù)選擇中要合理選擇恢復(fù)感覺功能的方法，防止足底及足后跟功能障礙[2-3]。當(dāng)前臨床上多采用皮瓣移植、電磁療法、高壓氧等多種治療手段促進(jìn)足底創(chuàng)面修復(fù)，但是很多機(jī)體在創(chuàng)面修復(fù)區(qū)往往出現(xiàn)觸覺功能的喪失，從而導(dǎo)致創(chuàng)面修復(fù)失敗。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，組織再生技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，其能促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)、再生和功能恢復(fù)[4]。其中觸覺與默克爾細(xì)胞(Merkel細(xì)胞)存在于表皮與真皮交界的網(wǎng)狀脊上，可與感覺傳入神經(jīng)纖維末梢緊密接觸，在皮膚觸覺高敏感區(qū)域數(shù)量較多，形成類似于神經(jīng)解剖上突觸結(jié)構(gòu)，可用于創(chuàng)面修復(fù)[5-6]。但是很多細(xì)胞工程在修復(fù)中容易出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，主要在于基質(zhì)攜帶有組織相容性復(fù)合抗原。去細(xì)胞異種神經(jīng)支架采用了化學(xué)萃取方法去除異種神經(jīng)的細(xì)胞和髓鞘形成無細(xì)胞基質(zhì)膜管，抑制了異體移植的免疫反應(yīng)，又能有效地促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生與修復(fù)[7]。且去細(xì)胞異種神經(jīng)支架不受取材限制，具有促進(jìn)軸突再生，能夠有效減少免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[8]。本文具體探討與分析了去細(xì)胞異種神經(jīng)支架對(duì)大鼠足底創(chuàng)面觸覺功能重建的影響，并簡單闡述了相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物 清潔級(jí)成年雄性Sprague-Dawly大鼠購自上海閔盛醫(yī)療科技有限公司，使用許可SYXK(滬)2021-0020。雄性，3月齡，體重180～220 g。所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，通風(fēng)良好，自然采光，每4～6只一籠飼養(yǎng)，普通飼料與墊料，明暗時(shí)間設(shè)定為12 h∶12 h，可自由攝取食物和水，濕度60%～70%，室溫控制在(22±1)℃。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。大鼠在飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

痛覺測(cè)試儀購自香港友誠生物科技有限公司；肌源性干細(xì)胞、去細(xì)胞異種神經(jīng)支架保存于本實(shí)驗(yàn)室；胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶(批號(hào)：S9020、T8150、31600，均購自Solarbio公司)；兔抗大鼠細(xì)胞角蛋白-20(Cytokeratin-20，CK-20)單克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、兔抗大鼠代謝型谷氨酸受體5(Metabotropic glutamate receptors，mGluR5)單克隆抗體(批號(hào)：ab76126、ab8226、ab76316，均購自英國Abcam公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：P0012S，購自上海碧云天生物科技有限公司)；多聚甲醛、無水乙醇[批號(hào)：441244、1012772，均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.2 大鼠足底創(chuàng)面模型的建立 大鼠腹腔內(nèi)注射4.0%水合氯醛(10.0 ml/kg)，麻醉成功后，0.5%聚維酮碘溶液消毒大鼠足底，然后逐層深切，確保切除深度達(dá)筋膜層6 mm×5 mm的皮膚全層，建模后大鼠分籠飼養(yǎng)，從而建立足底全層皮膚缺損大鼠模型。

1.3 大鼠分組與處理 將大鼠足底創(chuàng)面模型(n=48)隨機(jī)平分為三組：模型組、干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組(肌源性干細(xì)胞+去細(xì)胞異種神經(jīng)支架)。模型組不進(jìn)行治療，干細(xì)胞組將培養(yǎng)良好的肌源性干細(xì)胞(濃度為107個(gè)/ml)細(xì)胞懸液注射到創(chuàng)傷部位，神經(jīng)支架組在干細(xì)胞組治療的基礎(chǔ)上以注射植入后的細(xì)胞異種神經(jīng)支架進(jìn)行橋接，吻合口以9-0絲線吻合。所有大鼠皮下注射抗菌藥物以防止局部感染。

1.4 觀察指標(biāo) ①所有大鼠都在治療第7天與第14天進(jìn)行足底創(chuàng)面機(jī)械痛閾測(cè)定：將大鼠單獨(dú)置于鼠籠中，安靜放置1 h適應(yīng)周圍環(huán)境后，采用弗萊毛分別測(cè)試大鼠的機(jī)械痛閾(檢測(cè)區(qū)域固定在足底創(chuàng)面中央)，每種型號(hào)弗萊毛刺激10次，以出現(xiàn)5次以上縮腳反應(yīng)為陽性，其中能夠引發(fā)迅速縮腳反應(yīng)的最小力度為機(jī)械性痛閾閾值。②所有大鼠在治療第7天與第14天進(jìn)行步態(tài)測(cè)定:測(cè)定與記錄足底神經(jīng)指數(shù)，0為正常值，-100為完全離斷。同時(shí)用肌電圖儀檢測(cè)足底神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。③三組分別與治療第14天與第21天分別處死8只大鼠，取大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織，置于4.0%多聚甲醛溶液中后制成病理切片，1.0%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，樹脂包埋，使用Image 5.0圖像分析軟件進(jìn)行定量測(cè)量，計(jì)算與記錄同一平均面積的有髓神經(jīng)纖維數(shù)量。④大鼠足底創(chuàng)面新生肉芽組織，研磨后提取總蛋白，離心后取上清液，進(jìn)行蛋白定量，上樣后電泳2.5 h，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h；加入一抗抗體(1∶1000)，孵育(4 ℃，過夜)，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯影后進(jìn)行曝光，確定目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素或多因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 機(jī)械痛閾變化比較 干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第7天與第14天的機(jī)械痛閾高于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組高于干細(xì)胞組(P<0.05)，見表1。

2.2 足底神經(jīng)指數(shù)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度變化比較 干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第7天與第14天的足底神經(jīng)指數(shù)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度高于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組高于干細(xì)胞組(P<0.05)，見表2。

2.3 有髓神經(jīng)纖維數(shù)量變化比較 干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第14天與第21天的有髓神經(jīng)纖維數(shù)量高于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組高于干細(xì)胞組(P<0.05)，見表3。

表1 三組治療后不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾變化比較(g)

表2 三組治療后不同時(shí)間點(diǎn)足底神經(jīng)指數(shù)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度變化比較

2.4 CK-20與mGluR5蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第14天與第21天的CK-20與mGluR5蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組低于干細(xì)胞組(P<0.05)，見表4。

3 討 論

皮膚是體內(nèi)與體外環(huán)境接觸的重要媒介，尤其是足底皮膚上存在大量復(fù)雜的觸覺感受器，可幫助機(jī)體感知外環(huán)境的變化刺激。足底創(chuàng)傷在臨床上比較常見，多為外傷導(dǎo)致，其在修復(fù)時(shí)要求重建感覺[9]。皮瓣修復(fù)的成功率比較高，但是很難改善機(jī)體的足底感覺功能。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用組織工程技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)面修復(fù)得到了廣泛應(yīng)用[10]。肌源性干細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于制備組織化神經(jīng)在實(shí)驗(yàn)研究中取得了很好的效果。而去細(xì)胞基質(zhì)是近年來在各學(xué)科受到重視的生物衍生材料，具有更好的生物相容性，有利于組織、器官的修復(fù)[11]。

表4 三組治療后不同時(shí)間點(diǎn)CK-20與mGluR5蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

本研究顯示干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第7天與第14天的機(jī)械痛閾高于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組高于干細(xì)胞組(P<0.05)；干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第7天與第14天的足底神經(jīng)指數(shù)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度高于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組高于干細(xì)胞組(P<0.05)，表明去細(xì)胞異種神經(jīng)支架在大鼠足底創(chuàng)面的應(yīng)用有利于觸覺功能重建，提高足底神經(jīng)指數(shù)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度。從機(jī)制上分析，去細(xì)胞異種神經(jīng)支架保留了基底膜、外膜、神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)束膜等組織，清除了相關(guān)細(xì)胞和髓鞘及其碎片，具有完整的神經(jīng)基底膜管和纖維支架結(jié)構(gòu)，可保護(hù)受損神經(jīng)元生存，降低免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生率，從而促進(jìn)創(chuàng)面觸覺功能恢復(fù)[12-13]。

觸覺感受器可以通過機(jī)械激活的離子通道等把機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺芷魃系碾娦盘?hào)形成感受器電位，然后傳輸高級(jí)神經(jīng)中樞，產(chǎn)生觸摸感覺[14]。生物工程材料是指天然生物組織經(jīng)過特殊處理后形成的一種生物材料，其中去細(xì)胞異種神經(jīng)支架具有很好的安全性，不會(huì)引起與加重炎性反應(yīng)，具有良好的生物相容性與空間結(jié)構(gòu)，適用于組織工程化人工神經(jīng)的研制[15]。本研究顯示干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第14天與第21天的有髓神經(jīng)纖維數(shù)量高于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組高于干細(xì)胞組(P<0.05)，表明去細(xì)胞異種神經(jīng)支架在大鼠足底創(chuàng)面的應(yīng)用能增加有髓神經(jīng)纖維數(shù)量。當(dāng)前也有研究顯示去細(xì)胞異種神經(jīng)支架促進(jìn)其分泌神經(jīng)生長所需活性物質(zhì)，還可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分裂增殖，從而更有效地促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)[16]。并且去細(xì)胞異種神經(jīng)支架還可以通過逆運(yùn)輸?shù)竭_(dá)相應(yīng)神經(jīng)中樞，減少了神經(jīng)元的凋亡，對(duì)中樞神經(jīng)元與軸突起到一定的保護(hù)作用[17]。

CK-20蛋白是反應(yīng)觸覺功能的重要蛋白，正常大鼠網(wǎng)狀脊或肉芽組織中均有CK-20陽性細(xì)胞表達(dá)，CK-20蛋白水平降低表明創(chuàng)面新生肉芽組織中Merkel細(xì)胞存在丟失，導(dǎo)致神經(jīng)功能恢復(fù)能力下降[18]。mGluR5屬G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，可中介中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞，通過神經(jīng)元的中樞敏化參與神經(jīng)痛的發(fā)生。 GluR5分布于脊髓和大腦的各種結(jié)構(gòu)中，參與疼痛的調(diào)控以及對(duì)傷害性刺激的有效應(yīng)答，在疼痛部位注射GluR5受體拮抗劑可以調(diào)控局部或全身疼痛反應(yīng)[19]。去細(xì)胞異種神經(jīng)支架的制作工藝簡便易行，自身通透性好，來源容易，不受取材的限制。去細(xì)胞異種神經(jīng)支架允許各種營養(yǎng)物質(zhì)在管內(nèi)外自由交換及血管長入，具有極低的抗原性，同時(shí)保留了促進(jìn)神經(jīng)再生的營養(yǎng)成分，為神經(jīng)再生提供有利的微環(huán)境[20-21]。本研究顯示干細(xì)胞組、神經(jīng)支架組治療第14天與第21天的CK-20與mGluR5蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組(均P<0.05)，神經(jīng)支架組低于干細(xì)胞組(P<0.05)，表明去細(xì)胞異種神經(jīng)支架在大鼠足底創(chuàng)面的應(yīng)用能抑制CK-20與mGluR5蛋白的表達(dá)。不過本研究也存在一定的不足，動(dòng)物建模中均使用成年雌性大鼠，未能體現(xiàn)同種族、不同性別的差異性，且大鼠行為存在隨意性，將在后續(xù)研究中深入探討。

綜上所述，去細(xì)胞異種神經(jīng)支架在大鼠足底創(chuàng)面的應(yīng)用能抑制CK-20與mGluR5蛋白的表達(dá)，有利于觸覺功能重建，提高足底神經(jīng)指數(shù)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度，增加有髓神經(jīng)纖維數(shù)量。