崔小穎，林炳耀，袁奕武，林政杏，林東子

(1.佛山市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 佛山528000；2.佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 佛山528000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2019 年全球結(jié)核病報(bào)告，2018 年新發(fā)肺結(jié)核患者約1 000 萬，估算新發(fā)耐多藥(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)/利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin resistant tuberculosis，RR-TB)患者約48.4 萬例，其中我國MDR-TB/RRTB 發(fā)病數(shù)位居全球第二位(14%)［1］。2018 年，全球約145.1 萬人死于結(jié)核病，治療覆蓋率只有69%，MDR-TB/RR-TB 治療成功率僅有56%［1-2］。提早診斷并明確耐藥類型對治療效果尤其重要，而這非常依賴結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性測試。

當(dāng)前，結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性測試的主要方法包括表型藥敏試驗(yàn)、分子藥敏試驗(yàn)等。其中，結(jié)核分枝桿菌藥敏的金標(biāo)準(zhǔn)為“比例法”，操作過程復(fù)雜、耗時長，且無法測定結(jié)核菌最小抑菌濃度值(MIC)，只能間接判斷測試藥物的敏感或耐藥性，限制了其臨床應(yīng)用［3-4］；分子藥敏試驗(yàn)可縮短檢驗(yàn)時間，但其檢測藥物位點(diǎn)不全且藥物種類較少［5-6］。近年來，采用微量肉湯稀釋法測試結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群藥敏結(jié)果的微孔板法也有報(bào)道［7-8］，該法報(bào)告時間明顯縮短，并可檢測多種藥物多濃度梯度。

本研究采用美國賽默飛世爾公司生產(chǎn)的Sensititre?結(jié)核微孔藥敏板，分析2018－2019 年佛山地區(qū)分離的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株對一線抗結(jié)核藥物(利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇)的最小抑菌濃度，旨在評估我市結(jié)核分枝桿菌的最小抑菌濃度分布狀況，考察微孔板法的潛在使用優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

將2018 年1 月至2019 年12 月在佛山市第四人民醫(yī)院就診的結(jié)核病患者作為研究對象，收集患者痰液及肺泡灌洗液等結(jié)核菌培養(yǎng)送檢標(biāo)本9 209例。本研究經(jīng)佛山市第四人民醫(yī)院倫理委員會審核(倫理號2020020)。

1.2 耐藥分類［9］

單耐藥：僅對1 種一線抗結(jié)核藥物耐藥；多耐藥：對1 種以上一線抗結(jié)核藥耐藥(不包括同時對異煙肼和利福平耐藥)；耐多藥：至少同時對異煙肼和利福平耐藥；任一耐藥：1 種及以上抗結(jié)核藥耐藥。

1.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

1.3.1 培養(yǎng)鑒定相關(guān)試劑 羅氏培養(yǎng)基以及對硝基苯甲酸含藥羅氏培養(yǎng)基均購自于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。Sensititre?結(jié)核藥敏相關(guān)試劑Sensititre?結(jié)核藥敏板、含玻璃珠的吐溫鹽水、含有OADC 的7H9 肉湯等均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。Sensititre?結(jié)核藥敏板的藥物排列和藥物濃度，見表1。

表1 Sensititre?結(jié)核藥敏板的藥物排列和藥物濃度（μg/mL）

1.3.2 相關(guān)儀器 Sensititre?比濁儀、Sensititre?Autoinoculator?/AIM?接種儀以及Vizion 藥敏判讀系統(tǒng)均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀購自于廣東體必康生物科技有限公司。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法 Sensititre?結(jié)核藥敏操作方法：從羅氏培養(yǎng)基上刮取菌落到生理鹽水管中，使用細(xì)菌超聲分散儀使菌落分散，使用Sensititre?比濁儀調(diào)整濁度至0.5 McFarland 標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)移100 μL 懸浮液至含有OADC 的7H9 藥敏接種培養(yǎng)液中，漩渦振蕩混勻30 s，使接種液最終濃度在5×104～5×105CFU/mL 范圍內(nèi)。使用Sensititre?Autoinoculator?/ AIM?接種藥敏板，密封板條，放入35～37 ℃恒溫箱孵育。根據(jù)藥敏板2個生長對照孔(11H 孔和12H 孔)的生長情況，在10～21 d 內(nèi)使用Vizion?系統(tǒng)判讀結(jié)果。記錄生長明顯減少的最低抗生素濃度為MIC值，并依據(jù)CLSI M24-A2 文件結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測中各藥物的臨界濃度為判定折點(diǎn)，如果MIC 值≤臨界值為敏感(S)，否則則為耐藥(R)。各藥物的臨界濃度見表2。

表2 抗結(jié)核藥物臨界濃度參考值范圍

1.4 質(zhì)量控制

每批次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)控1 次。質(zhì)控菌株為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv，該菌株對所有的抗結(jié)核藥物均敏感。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，采取χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群培養(yǎng)陽性率

9 209例送檢標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群3 180株，陽性率為34.53%，其中2 018 年1 608 株、2019年1 572 株，2019 年結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率較2018 年有所下降(χ2＝14.30，P＜0.05)，見表3。

表3 2018 年與2019 年9 209例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

2.2 結(jié)核菌培養(yǎng)耐藥情況

3 180 株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中敏感株占86.92%(2 764 株)、耐藥株占13.08%(416 株)，總耐藥率13.08%(416/3 180)，其中單耐藥率6.76%(215/3 180)、耐多藥率4.72%(150/3180)、多耐藥率1.60%(51/3180)。耐藥譜共有15 種組合，其中單耐藥4 種、耐多藥4 種、多耐藥7 種。2018 年和2019 年單耐藥、多耐藥比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝1.516，0.390，P＞0.05)；2018 年和2019 年耐多藥比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2 ＝8.234，P＜0.05)，見表4。

表4 2018 年與2019 年結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株抗結(jié)核藥物耐藥情況

2.3 耐藥藥物濃度分布分析

一線抗結(jié)核藥耐藥順位分別是異煙肼(9.91%)、利福平(5.75%)、鏈霉素(5.41%)、乙胺丁醇(2.08%)。2018 年與2019 年高濃度(≥16 μg/mL)利福平耐藥情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝8.931，P＜0.05)，其他各藥物濃度耐藥差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。利福平分別與異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇共同耐藥占利福平耐藥株的81.97%(150/183)、38.8%(71/183)、25.14%(46/183)。高濃度利福平(≥16 μg/mL)耐藥時，與異煙肼共同耐藥占比為95.12% (156/164)，且中高濃度異煙肼(≥2 μg/mL)耐藥占59.15%(97/164)，見表5。

表5 2018 年與2019 年結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株抗結(jié)核藥物耐藥濃度分布情況

3 討論

在最新的世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病報(bào)告中，我國的發(fā)病率有所下降，但耐多藥結(jié)核病的增長，給臨床治療仍帶來了極大的困難［10］。臨床上僅依賴于能夠識別結(jié)核分枝桿菌的技術(shù)是不足夠的，抗結(jié)核藥物的合理使用才能控制耐藥結(jié)核病的流行與死亡率的控制［11］。藥敏試驗(yàn)是確定耐藥情況的關(guān)鍵，根據(jù)藥敏試驗(yàn)制定個體化藥物治療方案，對于耐藥結(jié)核病的控制意義重大。

2018-2019 年我院臨床分離培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群仍以敏感株為主(86.92%)，其中2019 年總耐藥率、多耐藥率均與2018 年基本持平，而耐多藥率出現(xiàn)明顯下降。與廣東省數(shù)據(jù)相比，我市兩年總耐藥率、多耐藥率低于廣東省平均水平線(23.05%、5.98%)，但是耐多藥率整體高于廣東省平均水平(4.09%)［12］，我市耐多藥結(jié)核病防治工作形勢依然嚴(yán)峻。

在4 種一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)中，我市結(jié)核病耐藥率順位分別是異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇。根據(jù)藥物耐藥濃度分析，利福平以高濃度耐藥為主，占比高達(dá)80%以上，2019 年比2018 年還有所增長，建議臨床結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理用藥。國外有報(bào)道約90%的耐利福平菌株也同時耐異煙肼［13］，這樣單獨(dú)進(jìn)行利福平的藥物敏感性試驗(yàn)即可初步判斷細(xì)菌的耐藥譜，可作為耐多藥的篩選指標(biāo)。我市的結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性與異煙肼耐藥性有一定的關(guān)聯(lián)性，低于國外報(bào)道的90%，但高于廣州報(bào)道的74.1%［14］。與此同時，當(dāng)利福平處于高濃度(≥16 μg/mL)耐藥時，異煙肼耐藥濃度也主要集中在中高濃度(≥2 μg/mL)，可見利福平處于高濃度時耐藥時異煙肼也處于高濃度耐藥，這可能是耐多藥比例較高的原因之一，出現(xiàn)這種情況的原因可能是結(jié)核患者常規(guī)治療方案以利福平和異煙肼組合為主，緩慢而繁瑣的傳統(tǒng)培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)方法使恰當(dāng)?shù)闹委熝舆t，在此期間，耐藥菌株可能產(chǎn)生或繼續(xù)傳播。但異煙肼以低濃度耐藥為主，占比70%以上，提示臨床醫(yī)生可依據(jù)最小抑菌濃度藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，使用高劑量的異煙肼也可以對部分耐藥患者起到治療的效果。臨床經(jīng)常反饋傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示異煙肼耐藥，但使用異煙肼治療仍然有效的情況也印證了上述提示。

鏈霉素以高濃度耐藥占比為主，占比高達(dá)80%以上，這可能是80 年代以前肺結(jié)核患者治療方案以鏈霉素為主，而80 年代后期特別是90 年代以來采用了標(biāo)準(zhǔn)化治療方案，因而導(dǎo)致鏈霉素耐藥處于穩(wěn)定階段。乙胺丁醇以低濃度耐藥為主，占比70%以上，可以看出乙胺丁醇在我市具有較高的臨床抗結(jié)核價值。在臨床結(jié)核病的防治中可根據(jù)藥敏試驗(yàn)得出的最小抑菌濃度，結(jié)合患者情況及血藥濃度，制定個體化治療方案。同時為避免過早放棄使用異煙肼和利福平核心一線藥物，可以利用微孔板法發(fā)現(xiàn)低濃度耐藥的情況，為臨床藥物使用劑量提供參考［15］。此外，微孔板法藥敏試驗(yàn)過程操作相對簡便，減少了人工操作步驟，節(jié)約時間并減少人為誤差。微孔板法結(jié)果等待時間為10～21 d，比常規(guī)比例法縮短了等待時間，能更及時為臨床制定個體化治療方案提供參考依據(jù)。

綜上所述，在結(jié)核病防治策略中，由于常規(guī)培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)耗時較長，不可避免地出現(xiàn)了藥敏結(jié)果延遲，對臨床治療缺乏指導(dǎo)性，應(yīng)盡早進(jìn)行微孔板藥物敏感試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)得出的最小抑菌濃度，制定個體化結(jié)核治療方案，合理使用藥物，以防止新的耐藥結(jié)核菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散。