姚靜欣，林雯，李莉平

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州510180）

造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)是造血系統(tǒng)中一群罕見(jiàn)的細(xì)胞亞群，被定義為一類具有自我更新能力和分化成所有血細(xì)胞能力的前體細(xì)胞［1］，是所有造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的來(lái)源［2］。HSCs最直接的子細(xì)胞是多能祖細(xì)胞(multipotent progenitors，MPPs)，MPPs 的下游發(fā)育分支被進(jìn)一步定義為僅具有有限譜系分化能力的造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)［3］，包括普通髓系祖細(xì)胞(common myeloid progenitors，CMPs)［4］、巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞祖細(xì)胞(megakaryocyteerythroid progenitor cells，MEPs)［5］、粒細(xì)胞-巨細(xì)胞祖細(xì)胞(granulocyte-macrophage progenitors，GMPs)和普通淋巴祖細(xì)胞(common lymphoid progenitors，CLPs)［6，7］。HSCs 和HPCs 又可被統(tǒng)稱為造血干祖細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)，這些細(xì)胞是維持體內(nèi)造血平衡的關(guān)鍵［8］。

成人HSCs 主要位于骨髓中，其數(shù)量在穩(wěn)態(tài)條件下受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)［9］。然而，造血應(yīng)激狀態(tài)，如感染、晚期腫瘤、貧血和妊娠等，可誘發(fā)髓外造血［10］，促進(jìn)HSCs 的增殖和動(dòng)員HSCs 至包括脾在內(nèi)的髓外組織，擴(kuò)大HSCs 的數(shù)量并增加造血功能，以支持血容量的快速擴(kuò)充［11］。在穩(wěn)態(tài)條件下調(diào)節(jié)HSCs 功能的機(jī)制已被廣泛研究，但是對(duì)于妊娠期間的造血應(yīng)激及HSCs 活化的調(diào)節(jié)機(jī)制則知之甚少。

妊娠期間雌激素和孕激素明顯上調(diào)［12］。雌激素不僅影響包括性器官和大腦在內(nèi)的組織的干細(xì)胞［13］，還參與調(diào)節(jié)造血多能干細(xì)胞的增殖分化及其微環(huán)境［14］。Nakada 等［15］發(fā)現(xiàn)，雌二醇(estrodiol，E2)不僅能夠增強(qiáng)HSCs 的自我更新，而且還能促進(jìn)HSCs 向MEPs 方向進(jìn)行不對(duì)稱自我更新。Choi等［16］發(fā)現(xiàn)，E2 顯著增加HPCs 產(chǎn)生的菌落總數(shù)。此外，孕酮(progesterone，P4)也能夠促進(jìn)成人乳腺干細(xì)胞的擴(kuò)增［17］。但雌、孕激素在HSCs 增殖中的作用尚未完全闡明，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常孕婦和未孕女性外周血中HSCs 占單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)的比率及HPCs 不同亞群占MPPs 的比率；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)及流式細(xì)胞術(shù)觀察雌、孕激素作用下CD34+臍血來(lái)源的HSCs 的增殖情況，旨在探討雌、孕激素在CD34+臍血來(lái)源的HSCs 增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，研究對(duì)象均簽署知情同意書。將2020 年4 月至2021 年3 月我科收治的62 名正常足月孕婦作為實(shí)驗(yàn)組，收集26例孕婦外周血及36例孕婦臍靜脈血，妊娠孕周均通過(guò)早期B 超檢查確認(rèn)，排除妊娠并發(fā)癥及感染癥狀，并因社會(huì)因素要求剖宮產(chǎn)結(jié)束分娩。選取24 名正常未孕成年女性作為對(duì)照組，收集外周血。兩組臨床特征見(jiàn)表1。

表1 受試女性臨床特征

1.2 標(biāo)本采集及處理

孕婦手術(shù)前30 min，一次性真空采血管抽取外周血5 mL。胎兒娩出后，一次性塑料血袋抽取臍靜脈血60～100 mL。

1.3 外周血和臍血單個(gè)核細(xì)胞分離

PBS 將外周血及臍血標(biāo)本稀釋一倍。2∶1 比例加入到人淋巴細(xì)胞分離液中，800 g，20℃離心20 min。從云霧狀的中間層小心吸取單個(gè)核細(xì)胞，移入另一離心管，PBS 300 g 離心10 min，洗滌2 次，棄上清。含2%胎牛血清(Thermo Fisher Scientific，Grand Island，USA)的PBS 重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。

1.4 臍血CD34+細(xì)胞的分選

臍血單個(gè)核細(xì)胞懸液4℃，300 g 離心10 min，棄上清，重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為108/100 μL，加入100 μL 封閉液(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，4℃封閉10 min，加入100 μL CD34 磁珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，4℃孵育30 min。用 含1% EDTA(Solarbio，Beijing，China)的PBS 洗滌1 次，細(xì)胞重懸至3 mL。將LS分離柱固定于磁鐵上，PBS 洗滌1 次。將細(xì)胞懸液加入LS 柱，使其自然過(guò)柱并收集陰選細(xì)胞。PBS 洗滌LS 柱3 次后將LS 柱從磁鐵上取下，用3 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific，Grand Island，USA)把結(jié)合到LS 柱上的細(xì)胞吹打出來(lái)，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL。

1.5 臍血干細(xì)胞的培養(yǎng)及雌、孕激素刺激

將分選后的CD34+細(xì)胞置于24孔或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1×105/mL，加入無(wú)血清擴(kuò)增培養(yǎng)基(Vancouver，Canada)及終濃度分別為10 U/mL 的青霉素(LA，USA)、10 μg/mL的鏈霉素(LA，USA)、100 ng/mL 的干細(xì)胞因子(PeproTech，New Jersey，USA)、100 ng/mL 的FMS 相關(guān)酪氨酸激酶3配體(Biolegend，San Diego，USA)以及100 ng/mL的促血小板生成素(Pepro Tech，New Jersey，USA)，再分別加入終濃度為50 ng/mL 的E2 (Med Chem Express，New Jersey，USA) 和500 ng/mL 的P4(Med Chem Express，New Jersey，USA)。以不加激素者作為對(duì)照組，24 孔板定容1 mL，96 孔板定容100 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d 傳代1 次。

1.6 羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(CFSE)染色

調(diào)整分選后的細(xì)胞濃度為1×107/mL，加入終濃度為5 μmol/L 的CFSE (Biolegend，San Diego，USA)，充分混勻，室溫下避光放置20 min。以PBS和RPMI 1640分別離心300 g，5 min，洗滌細(xì)胞1次，重懸于RPMI 1640，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，按上述培養(yǎng)方案于24 孔板中培養(yǎng)48 h 和72 h。FACSCanto II 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，San Jose，USA)檢測(cè)CFSE 含量下降的HSCs 占總細(xì)胞群的比率。FlowJo 軟件(FlowJo，LLC，Ashland，OR，USA)分析數(shù)據(jù)，Modfit 軟件(ModFit LT，Verity Software House，Topsham，ME，USA)分析增殖指數(shù)。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)12 次。

1.7 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖

培養(yǎng)3、5、7d，每孔添加10μL CCK-8(Meilunbio，Dalian，China)，37℃、5% CO2孵育8 h。酶標(biāo)儀(Eon，BioTeck，CA，USA)450 nm 下測(cè)量光密度(optical density，OD)值，參比波長(zhǎng)為650 nm，OD 值＝A450 值-A650 值。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)12 次。

1.8 熒光抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)及分析

外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液PBS 離心300 g，5 min，洗滌2 次，50 μL PBS 重懸，每管樣品加入FITC 標(biāo)記的抗人Lineage Cocktail、APC 標(biāo)記的抗人CD34、PE標(biāo)記的抗人CD38、APC/Cy7標(biāo)記的抗人CD45RA 及PE/Cy7 標(biāo)記的抗人CD123 (Biolegend，San Diego，USA)各5 μL，混勻后4℃避光孵育30 min。PBS 洗滌2 次，含2% FBS 的PBS 300 μL 重懸細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)3、5、7 d，將24 孔板取出，收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，50 μL PBS 重懸，每管樣品加入FITC 標(biāo)記的抗人Lineage Cocktail 和APC 標(biāo)記的抗人CD34 (Biolegend，San Diego，USA)各1 μL，混勻后4℃避光孵育30 min。PBS 洗滌2 次，含2% FBS的PBS 300 μL 重懸細(xì)胞。

采用 FACSCanto II 流式細(xì)胞儀 (BD Biosciences，San Jose，USA)檢測(cè)外周血中HSCs(Lin-CD34+細(xì)胞)占MNCs的比率，MPPs (Lin-CD34+CD38+細(xì)胞)占HSCs的比率，CMPs(Lin-CD34+CD38+CD123+CD45RA-細(xì)胞)、MEPs (Lin-Lin-CD34+CD38+CD123-CD45RA-細(xì)胞)及GMPs(Lin-CD34+CD38+CD123+CD45RA+細(xì)胞)占MPPs的比率，檢測(cè)Lin-CD34+HSCs 和Lin-細(xì)胞的數(shù)量。FlowJo 軟件(FlowJo，LLC，Ashland，OR，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)12 次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad Prism 8.4.0 軟件(San Diego，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠女性外周血HSCs 和HPCs 各亞群占比變化

相對(duì)于未孕女性，妊娠女性外周血中的HSCs比率增高(P＜0.05，圖1A-C)，MPPs 占HSCs 的比率無(wú)明顯差異(圖1A、B 和D)，CMPs 占MPPs 的比率明顯降低(P＜0.01，圖1A、B 和E)，而MEPs 及GMPs 占MPPs 的比率顯著增高(P＜0.01，P＜0.05，圖1A、B、F 和G)。

圖1 外周血HSCs 和HPCs 各亞群占比

2.2 臍血HSCs 的分選結(jié)果

臍血中HSCs 占MNCs 的比率為(1.42 ±0.48)%，分選后HSCs 占MNCs 的比率為(95.3±2.76)%，＞90%，表明用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的HSCs 純度高，適用于進(jìn)一步進(jìn)行增殖能力評(píng)估(圖2)。

圖2 臍血HSCs 占MNCs 的比率

2.3 雌孕激素作用下HSCs 中CFSElow 細(xì)胞占比和

相對(duì)于未給藥組，50 ng/mL E2 作用48、72 h后，HSCs 中CFSElow 細(xì)胞占總體細(xì)胞的比率均明顯增高(P＜0.05，P＜0.01，圖3A-C)，HSCs 的增殖指數(shù)也均明顯增高(P＜0.05，P＜0.01，圖3D)；500 ng/mL P4 作用72 h 后，HSCs 中CFSElow 細(xì)胞占總體細(xì)胞的比率明顯增高(P＜0.05，圖3A-C)，HSCs 的增殖指數(shù)也明顯增高(P＜0.01，圖3D)。

圖3 體外培養(yǎng)過(guò)程中HSCs 中CFSElow 細(xì)胞占總體細(xì)胞的比率和HSCs 的PI

2.4 雌孕激素作用下HSCs 的活細(xì)胞數(shù)變化

相對(duì)于未給藥組，50 ng/mL E2 作用5、7 d 后，HSCs 在450 nm 處的OD 值均明顯增高(P＜0.01，圖4A)；500 ng/ml P4 作用7 d 后，HSCs 在450 nm 處的OD 值明顯增高(P＜0.01，圖4A)。相對(duì)于未給藥組，50 ng/ml E2 作用5、7 d 后，HSCs 的活細(xì)胞數(shù)均明顯增高(P＜0.01，圖4B)，Lin-細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)也明顯增高(P＜0.01，圖4C)；500 ng/mL P4 作用7 d后，HSCs 活細(xì)胞數(shù)明顯增高(P＜0.05，圖4B)，Lin-細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)明顯增高(P＜0.05，圖4C)。

圖4 體外培養(yǎng)過(guò)程中HSCs 的OD 值和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所得活細(xì)胞數(shù)

3 討論

本研究采用表面抗體標(biāo)記Lin-CD34+代表HSCs［18］，檢測(cè)HSCs 占PBMCs 的比率，以此探究妊娠對(duì)女性HSCs 數(shù)量的影響，結(jié)果顯示，與未孕女性相比，妊娠女性外周血HSCs 占MNCs 的比率明顯增加；妊娠期間造血活動(dòng)明顯增強(qiáng)，能促進(jìn)HSCs 增殖。Nakada 等［15］的研究也表明，與未孕雌鼠相比，孕鼠骨髓和脾臟中HSCs 數(shù)量和增殖頻率均明顯增高；與雄鼠相比，HSCs 在雌鼠骨髓中的分裂頻率更高。Ganguly 等［19］發(fā)現(xiàn)，雌鼠骨髓及脾臟中HSCs 的比例和數(shù)量在妊娠第14 天顯著增加，產(chǎn)后則迅速下降。

本研究結(jié)果還顯示，與未孕女性相比，妊娠女性外周血CMPs 占MPPs 的比率明顯降低，而CMPs 下游細(xì)胞MEPs 和GMPs 占MPPs 的比率明顯增高，這表明女性妊娠期間造血活動(dòng)明顯向紅系細(xì)胞及髓系細(xì)胞分化偏移。Oguro 等［20］發(fā)現(xiàn)，與未孕雌鼠相比，孕鼠脾臟中的HSCs、CMPs、GMPs 和MEPs 數(shù)量均顯著增高，Nakada 等［15］發(fā)現(xiàn)，雌鼠中MEPs 的比率較雄鼠明顯增高，這些HPCs 亞群數(shù)量的增加也側(cè)面印證了HSCs分裂的增加。鑒于MEPs 可能直接來(lái)自HSCs 的不對(duì)稱分裂［21］，妊娠期女性MEPs 比例的增加可能反映了女性HSCs 對(duì)性激素反應(yīng)的不對(duì)稱自我更新增加。

本研究結(jié)果表明，與未給藥組相比，E2 作用48、72 h 及P4 作用72 h 后，HSCs 中CFSElow 細(xì)胞占總體細(xì)胞的比率均明顯增高，且HSCs 的增殖指數(shù)也明顯增高。與未給藥組相比，E2 作用5、7 d 及P4作用7 d 后，HSCs 的OD 值明顯增高，HSCs 和Lin-細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)明顯增加。上述結(jié)果與CFSE 檢測(cè)結(jié)果略有落差，考慮為CCK-8 和流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)與CFSE 檢測(cè)細(xì)胞增殖的角度不同所致，CCK-8 與流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)對(duì)活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)易受細(xì)胞狀態(tài)影響，而CFSE 對(duì)處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞比例的檢測(cè)更為直觀。此外，雖然CFSE 結(jié)果表明，相對(duì)于未給藥組，雌、孕激素組處于增殖狀態(tài)的HSCs 比例明顯增加，但從HSCs 增殖的提高到產(chǎn)生HSCs 數(shù)量上的明顯差異，需要一定的時(shí)間，而細(xì)胞在增殖的同時(shí)也存在衰老與凋亡［22］，對(duì)活細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生一定影響，故導(dǎo)致不同檢測(cè)方法所得結(jié)果存在一定差異。

關(guān)于雌激素促進(jìn)HSCs 增殖的作用，Kim 等［23］將從人臍血中富集的CD34+細(xì)胞置于E2 作用下培養(yǎng)，第10 天可觀察到CD34+細(xì)胞顯著增加，此外，E2除對(duì)臍血來(lái)源的HSCs 增殖有促進(jìn)作用外，還能改善人多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)的造血發(fā)育，使hSPCs 比例和數(shù)量增高。與本研究不同的是，Nakada 等［15］在對(duì)小鼠進(jìn)行雌激素給藥后，雖然觀察到小鼠骨髓中HSCs分裂頻率明顯增高，卻并未觀察到HSCs 數(shù)量明顯增加，這可能是因?yàn)镹akada 等［15］的檢測(cè)位置在骨髓，由于HSCs分裂后即有可能被立即動(dòng)員至循環(huán)或其他組織中，無(wú)法準(zhǔn)確反映HSCs 數(shù)量。Qiu 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)卵巢切除術(shù)，雌鼠骨髓中HSCs 的數(shù)量和功能顯著降低。

Nakada 等［15］研究表明，HSCs 高度表達(dá)雌激素受體-α(estrogen receptor-α，ERα)，并通過(guò)5-溴脫氧尿苷摻入的方式驗(yàn)證了E2 可以增加雌鼠骨髓中HSCs 的分裂。Oguro 等［20］也再次驗(yàn)證了E2 處理會(huì)誘導(dǎo)小鼠骨髓中HSCs 的分裂，ERα 的另一個(gè)配體27-羥基膽固醇可以誘導(dǎo)ERα 依賴性HSCs 的動(dòng)員。而與之相反的是，Illing 等［25］發(fā)現(xiàn)E2 會(huì)導(dǎo)致血管壁中的HSCs 數(shù)量增加，條件性敲除小鼠中編碼ERα的基因ESR1 后在小鼠骨質(zhì)不增加的情況下，血管壁中HSCs 數(shù)量增加，這表明E2 是以自主的方式促進(jìn)血管壁中HSCs 增殖，而獨(dú)立于其ERα 依賴的合成代謝骨效應(yīng)。E2 對(duì)于HSCs 的調(diào)節(jié)機(jī)制及不同通路間可能的交互作用仍需要進(jìn)一步的探索。

大量研究表明，雌激素可能通過(guò)不同途徑影響造血細(xì)胞的分化活性。E2 可以通過(guò)激活雌激素受體-β 劑量依賴性促進(jìn)巨核系細(xì)胞的多倍體化和成熟，同時(shí)上調(diào)促巨核細(xì)胞分化基因GATA-1 的表達(dá)［26］。在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子存在的條件下，E2 可以通過(guò)ERα 介導(dǎo)，促進(jìn)髓系祖細(xì)胞分化出具有朗格漢斯細(xì)胞特征的的樹突狀細(xì)胞［27］。雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致骨髓中B 細(xì)胞祖細(xì)胞數(shù)量增加［28］。但本研究細(xì)胞培養(yǎng)體系為維持HSCs 干性的增殖體系，缺乏誘導(dǎo)HSCs分化的細(xì)胞因子，故無(wú)法體現(xiàn)E2對(duì)HSCs分化的影響，有待進(jìn)一步細(xì)化方案，以探究雌激素在HSCs分化中的作用。

作為另一種重要的性激素，P4 參與女性妊娠和性器官發(fā)育成熟。目前對(duì)于孕激素的研究仍主要集中于妊娠期間對(duì)子宮的維護(hù)，如抑制炎癥反應(yīng)［29］、改善子宮胎盤循環(huán)［30］、預(yù)防和治療先兆流產(chǎn)等［31］。關(guān)于孕激素在造血系統(tǒng)中的作用研究鮮少，本研究結(jié)果表明，除E2 外，P4 也具有促HSCs 增殖的作用。

此外，有研究結(jié)果顯示，P4 通過(guò)刺激孕激素受體介導(dǎo)的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，可促進(jìn)骨形成過(guò)程［32］。這個(gè)過(guò)程是E2 和P4 之間平衡的結(jié)果，E2 能迅速吸收骨骼，而P4 則能緩慢形成骨骼，反之，P4 水平下降會(huì)導(dǎo)致骨密度下降。Wu 等［33］研究發(fā)現(xiàn)，P4 可通過(guò)ERK 1/2 信號(hào)通路促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的纖連蛋白合成，以提高造血微環(huán)境的支持作用，從而增強(qiáng)造血功能。另一方面，在紅系造血活動(dòng)中，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是刺激紅細(xì)胞生成的重要細(xì)胞因子［34］，Ogawa 等［35］研究發(fā)現(xiàn)，P4 而非E2 可以顯著提高EPO 的生物活性，并通過(guò)促進(jìn)人羊膜上皮細(xì)胞合成EPO 來(lái)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成。此外，Joshi 等［17］研究表明，P4 能夠促進(jìn)成人乳腺干細(xì)胞和乳腺癌干細(xì)胞的擴(kuò)增。P4 抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β自分泌，阻止上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，維持羊膜上皮細(xì)胞的再生潛能［36］。以上研究提示，P4 對(duì)于不同細(xì)胞群生物活性的促進(jìn)作用是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞所在微環(huán)境中的細(xì)胞因子或與其他因素協(xié)同作用產(chǎn)生的。但目前P4 在HSCs 增殖過(guò)程中發(fā)揮作用的確切機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步探索P4 介導(dǎo)的造血功能和促進(jìn)HSCs 增殖的分子機(jī)制。

綜上所述，女性妊娠期間造血活動(dòng)明顯增強(qiáng)，且明顯向紅系細(xì)胞和髓系細(xì)胞分化偏移；雌、孕激素在妊娠期造血活動(dòng)中具有重要作用，能夠促進(jìn)CD34+臍血來(lái)源的HSCs 增殖。