李東原，王艷梅，吳博，閆美宏，畢華

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，陜西 延安716000）

放射治療是乳腺癌局部治療的重要手段，術(shù)前/術(shù)后放療對改善腫瘤局部控制率、降低局部復(fù)發(fā)率、延長患者長期生存期具有重要意義［1］。然而，放射抵抗可導(dǎo)致乳腺癌放射治療失敗。因此，關(guān)于乳腺癌放療抵抗的潛在機制值得探討。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，人類基因組中大于97%轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(ncRNA)，其中長鏈ncRNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)已被證實與乳腺癌細胞的異常增殖、轉(zhuǎn)移和放化療抵抗有關(guān)［2-3］。lncRNA 前列腺癌相關(guān)ncRNA 轉(zhuǎn)錄本1(PCAT1)是一種致癌因子，研究指出lncRNA PCAT1 高表達與胃癌順鉑耐藥、結(jié)直腸癌5-氟尿嘧啶耐藥相關(guān)，敲減lncRNA PCAT1 可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，并逆轉(zhuǎn)化療耐藥［4-5］。抑制lncRNA PCAT1 表達還可增加膠質(zhì)瘤肝細胞放射敏感性［6］。前期研究表明乳腺癌中l(wèi)ncRNA PCAT1 表達增加［7］，然而lncRNA PCAT1 對乳腺癌細胞增殖、凋亡以及放療抵抗的影響并不清楚。miR-329-3p 是宮頸癌抑癌因子，研究指出過表達miR-329-3p 對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用［8-9］。生物信息學(xué)分析顯示miR-329-3p 為lncRNA PCAT1 潛在下游靶基因?；谝陨涎芯亢皖A(yù)測，本研究推測lncRNA PCAT1 可能靶向miR-329-3p 在乳腺癌中發(fā)揮作用。本研究對乳腺癌細胞中l(wèi)ncRNA PCAT1 和miR-329-3p 表達水平進行檢測，并分析干擾lncRNA PCAT1 或過表達miR-329-3p 對乳腺癌細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響，以期為乳腺癌提供有效放療增敏靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

乳腺癌細胞系MCF-7、T47D、Bcap-37 以及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A 購于武漢普諾賽生命科技公司；miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒購于北京博凌科為生物公司；第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR Green master mix 試劑盒、噻唑藍(MTT)試劑盒購于北京百奧萊博生物科技公司；miR-329-3p 模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-329-3p 抑制物(anti-miR-329-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、針對lncRNA PCAT1 的小干擾RNA(si-lncRNA PCAT1)及其陰性對照(si-NC)、雙熒光素酶報告載體購于廣州銳博生物公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購于上海貝博生物公司；兔源CyclinD1、Cleaved-caspase-3、γ-H2AX 抗體、羊抗兔IgG 二抗購于上海艾博抗生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7 細胞，用RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)T47D、Bcap-37 細胞，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗。用DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-10A 細胞，培養(yǎng)基中添加5%馬血清和1%青鏈霉素雙抗。每周更換2～3 次培養(yǎng)液，按照1∶4 比例傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)期細胞進行后續(xù)研究。

1.2.2 實時定量PCR(RT-qPCR) 檢測lncRNA PCAT1 和miR-329-3p 表達 用TRIzol 試劑分離MCF-10A 細胞、MCF-7、T47D 以及Bcap-37 細胞總RNA，用第一鏈cDNA 合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，以其產(chǎn)物為模板利用SYBR Green master mix 試劑盒進行RT-qPCR，2-ΔΔCt方法檢測lncRNA PCAT1 表達。采用miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒檢測miR-329-3p表達。lncRNAPCAT-1上游引物5’-AATGGCATGAACCTGGGAGGCG-3’，下游引物5’-GGCTTTGGGAAGTGCTTTGGAG-3’；內(nèi)參β-actin 上游引物5’-TGGACTTCGA GCAGGAAATGG-3’，下游引 物 5’-ACGTCGCACTTCATGATCGAG-3’。miR-329-3p 上游引物5’-GTGGAACAGACCTGGTAAAC-3’，下游引物5’-CAAGTGCGAGTCGTGCAGT-3’；內(nèi)參U6 上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGG T-3’。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組 將對數(shù)期T47D 細胞按照2×105個/孔接種于96 孔板，將si-NC、si-lncRNA PCAT1、miR-NC、miR-329-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-329-3p、si-lncRNA PCAT1+anti-miR-NC、si-lncRNA PCAT1+anti-miR-329-3p 按照Lipofectamine 2000 說明轉(zhuǎn)染60%匯合的T47D 細胞，依次記為si-NC組、si-lncRNA PCAT1組、miR-NC組、miR-329-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-329-3p組、si-lncRNA PCAT1+anti-miR-NC組。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，按照1.2.2方法步驟提取總RNA，檢測轉(zhuǎn)染效果。未轉(zhuǎn)染的T47D 細胞記為正常對照(NC)組。

1.2.4 MTT 實驗檢測細胞活力 將轉(zhuǎn)染48 h 的T47D 細胞按照2×103個/孔接種于96 孔板中，48 h后，每孔中添加20 μL 的MTT 培養(yǎng)2 h，酶標儀在波長為490 nm 處檢測吸光度(A)值。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整轉(zhuǎn)染48 h 細胞密度為1×106個/mL。取5 μL的Annexin V-FITC、PI 加入到100 μL 細胞懸液中，避光染色10 min。補加1×結(jié)合緩沖液至500 μL。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 克隆形成實驗檢測細胞存活分數(shù) 將轉(zhuǎn)染48 h 的T47D 細胞按照5×102個/孔接種于6 孔板中，按照源靶距為100 cm，劑量率為5 Gy/min，照射野為10 cm×10 cm 給予細胞不同照射劑量(0、2、4、6、8 Gy)，射野完全覆蓋平板。放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1 天觀察細胞1 次，約14 d 左右出現(xiàn)肉眼可見細胞集落時終止培養(yǎng)。用甲醛固定細胞集落15 min，再用姬姆薩染色30 min。顯微鏡下統(tǒng)計細胞集落數(shù)，大于50個細胞的集落記為有效克隆。克隆形成率(PE)＝有效克隆數(shù)/細胞接種數(shù)×100%。存活分數(shù)(SF)＝照射組細胞PE 和對照組細胞PE的比值。分析細胞存活分數(shù)繪制細胞存活曲線，采用單擊多靶模型求出放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq、SF2、SER 值。放射增敏比為干擾(過表達)前組D0 和干擾(過表達)后組D0 比值

1.2.7 免疫印跡法檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3和γ-H2AX 表達 使用RIPA 緩沖液提取各組T47D細胞總蛋白。分析蛋白濃度后，將適量蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照1∶4 比例混勻，經(jīng)95 ℃水浴5 min變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。室溫環(huán)境下，將膜置于孵育盒中，加入5%脫脂牛奶封閉膜2 h，再用稀釋的CyclinD1 或Cleaved-caspase-3 或γ-H2AX 一抗溶液孵育膜2 h，最后用稀釋的二抗溶液孵育1 h。暗室內(nèi)滴加化學(xué)發(fā)光顯色液進行顯色反應(yīng)。Imagel J 軟件分析各條帶灰度值，采用目的蛋白和內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示相應(yīng)蛋白表達水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗 為檢測lncRNA PCAT1 和miR-329-3p 結(jié)合特異性，將含有miR-329-3p 結(jié)合位點的lncRNA PCAT1 野生序列或突變序列克隆到熒光素酶報告質(zhì)粒，構(gòu)建野生型/突變型熒光素酶報告載體(WT/MUT-lncRNA PCAT1)。將T47D 細胞接種到24 孔培養(yǎng)板，將WT/ MUTlncRNA PCAT1 與miR-329-3p mimics 或miR-NC 共轉(zhuǎn)染60%匯合細胞。培養(yǎng)48 h 后裂解細胞，使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。每組設(shè)置3個平行試驗，重復(fù)3 次。計量數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布以表示。兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本t檢驗；多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細胞系中l(wèi)ncRNA PCAT1、miR-329-3p表達情況

為了檢測lncRNA PCAT1、miR-329-3p 在乳腺癌細胞內(nèi)的表達情況，通過RT-PCR 方法對乳腺癌細胞內(nèi)lncRNA PCAT1、miR-329-3p 水平進行分析，發(fā)現(xiàn)與MCF-10A 細胞比較，乳腺癌細胞系MCF-7、T47D、Bcap-37 中l(wèi)ncRNA PCAT1 表達量顯著升高(P＜0.05)，miR-329-3p 表達量顯著降低(P＜0.05)。見表1。

表1 乳腺癌細胞系中l(wèi)ncRNA PCAT1、miR-329-3p表達（，n=9）

表1 乳腺癌細胞系中l(wèi)ncRNA PCAT1、miR-329-3p表達（，n=9）

注：與MCF-10A 比較，*P＜0.05；MCF-10A：正常乳腺上皮細胞

2.2 干擾lncRNA PCAT1 表達抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性

與si-NC 和NC組比較，si-lncRNA PCAT1組T47D細胞lncRNA PCAT1表達量、細胞活力、CyclinD1 蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)，凋亡率、γ-H2AX 和Cleaved-caspase-3 蛋白表達量顯著升高(P＜0.05)，見表2、圖1A 和圖1B。在2、4、6、8 Gy劑量下，與轉(zhuǎn)染si-NC 比較，轉(zhuǎn)染si-lncRNA PCAT1組T47D 細胞存活分數(shù)顯著降低(P＜0.05)，放射增敏比為1.265，見表2 和圖1C。

表2 干擾lncRNA PCAT1 表達抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性（，n=9）

表2 干擾lncRNA PCAT1 表達抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性（，n=9）

注：與si-NC 和NC 比較，*P＜0.05

圖1 干擾lncRNA PCAT1 表達抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性

2.3 過表達miR-329-3p 抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性

與miR-NC組比較，miR-329-3p組T47D 細胞miR-329-3p 表達量顯著升高(P＜0.05)，細胞活力、CyclinD1 蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)，凋亡率、γ-H2AX 和Cleaved-caspase-3 蛋白表達量顯著升高(P＜0.05)，見表4、圖2B。在2、4、6、8 Gy 劑量下，與轉(zhuǎn)染miR-NC 比較，轉(zhuǎn)染miR-329-3p組T47D 細胞存活分數(shù)顯著降低(P＜0.05)，放射增敏比為1.338，見表5 和圖2A。

表3 低表達lncRNA PCAT1 的T47D 細胞的放射增敏比

圖2 過表達miR-329-3p 抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性

表4 過表達miR-329-3p 抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性（，n=9）

表4 過表達miR-329-3p 抑制乳腺癌細胞T47D 增殖、誘導(dǎo)凋亡和增強放射敏感性（，n=9）

注：與miR-NC 比較，*P＜0.05

表5 過表達miR-329-3p 的T47D 細胞的放射敏增敏比

2.4 lncRNA PCAT1 靶向調(diào)控miR-329-3p 表達

Starbase 預(yù)測PCAT1 靶基因顯示miR-329-3p含有與PCAT1 連續(xù)特異性集合序列，見圖3。與轉(zhuǎn)染miR-NC 比較，轉(zhuǎn)染miR-329-3p 后T47D 細胞WT-lncRNA PCAT1 的相對熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)，而MUT-lncRNA PCAT1 的相對熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學(xué)意義，見表6。pcDNA-lncRNA PCAT1組T47D 細胞miR-329-3p 表達量顯著低于pcDNA-NC組(P＜0.05)；而si-lncRNA PCAT1組T47D 細胞miR-329-3p 表達量顯著高于si-NC組(P＜0.05)，見表7。

表6 相對雙熒光素酶活性檢測（，n=9）

表6 相對雙熒光素酶活性檢測（，n=9）

注：與miR-NC 比較，*P＜0.05。

表7 RT-qPCR 檢測miR-329-3p 的表達（，n=9）

表7 RT-qPCR 檢測miR-329-3p 的表達（，n=9）

注：與pcDNA-NC 比較，*P＜0.05；與si-NC 比較，＃P＜0.05

圖3 miR-329-3p 和lncRNA PCAT1 結(jié)合進行預(yù)測示意圖

2.5 下調(diào)miR-329-3p 能夠逆轉(zhuǎn)lncRNA PCAT1 低表達對T47D 細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響

與anti-miR-NC組比較，anti-miR-329-3p組T47D 細胞miR-329-3p 表達量顯著降低，細胞活力、CyclinD1 蛋白表達量顯著升高(P＜0.05)，凋亡率、γ-H2AX 和Cleaved-caspase-3 蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)；與si-lncRNA PCAT1+anti-miR-NC組比較，si-lncRNA PCAT1 +anti-miR-329-3p組T47D 細胞miR-329-3p 表達量顯著降低，細胞活力、CyclinD1蛋白表達量顯著升高(P＜0.05)，凋亡率、γ-H2AX 和Cleaved-caspase-3 蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)，見表8、圖4B。在2、4、6、8 Gy 劑量下，與轉(zhuǎn)染antimiR-NC 比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-329-3p組T47D 細胞存活分數(shù)顯著升高(P＜0.05)，放射增敏比為0.837；與轉(zhuǎn)染si-lncRNA PCAT1 和anti-miR-NC 比較，轉(zhuǎn)染si-lncRNA PCAT1 和anti-miR-329-3p組T47D 細胞存活分數(shù)顯著升高(P＜0.05)，放射增敏比為0.737，見表9 和圖4A。

表8 抑制miR-329-3p 能夠逆轉(zhuǎn)lncRNA PCAT1 低表達對T47D 細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響（，n=9）

表8 抑制miR-329-3p 能夠逆轉(zhuǎn)lncRNA PCAT1 低表達對T47D 細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響（，n=9）

表9 各組T47D 細胞的放射敏增敏比

圖4 抑制miR-329-3p 能夠逆轉(zhuǎn)lncRNA PCAT1 低表達對T47D 細胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響

2.6 Wnt/β-Catenin 信號通路相關(guān)蛋白表達

si-lncRNA PCAT1組T47D 細胞β-Catenin 蛋白表達量較si-NC組顯著降低(P＜0.05)；anti-miR-329-3p組T47D 細胞β-Catenin 蛋白表達量較antimiR-NC組顯著升高(P＜0.05)；si-lncRNA PCAT1+anti-miR-329-3p組T47D 細胞β-Catenin 蛋白表達量較si-lncRNA PCAT1+anti-miR-NC組顯著升高(P＜0.05)，見表10 和圖5。

圖5 Western Blot 檢測β-Catenin 蛋白表達

表10 Western Blot 檢測β-Catenin 蛋白表達（，n=9）

表10 Western Blot 檢測β-Catenin 蛋白表達（，n=9）

注：與si-NC 比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC 比較，＃P＜0.05；與si-lncRNA PCAT1+anti-miR-NC 比較，＆P＜0.05

3 討論

近年來，多項研究證實lncRNA 在細胞行為、癌癥發(fā)生、發(fā)病機制、化療和放療抵抗等方面發(fā)揮調(diào)控作用。lncRNA PCAT1 高表達與子宮內(nèi)膜癌國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)分期、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存期短呈正相關(guān)［10］。卵巢癌中l(wèi)ncRNA PCAT1 高表達通過靶向NEK2 顯著增加癌細胞的增殖和遷移潛能［11］。在多發(fā)性骨髓瘤中干擾lncRNA PCAT1表達可抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并增加多發(fā)性骨髓瘤細胞對硼替佐米的敏感性［12］。然而，目前l(fā)ncRNA PCAT1 在乳腺癌中的作用和對細胞放射敏感性影響并未闡明。本研究通過RT-qPCR 檢測乳腺癌細胞中l(wèi)ncRNA PCAT1 表達量，結(jié)果表明，乳腺癌細胞中l(wèi)ncRNA PCAT1 表達較正常乳腺上皮細胞顯著升高，這與前人報道結(jié)果基本吻合［13］。選擇表達差異較大的T47D 細胞進行功能實驗，結(jié)果表明，干擾lncRNA PCAT1 表達顯著下調(diào)促增殖蛋白CyclinD1 表達，上調(diào)凋亡效應(yīng)因子Cleaved-caspase-3表達，抑制T47D 細胞活力，誘導(dǎo)細胞凋亡率。雙鏈斷裂(DSBs)是放療誘導(dǎo)DNA 損傷的重要類型，在DSBs 后組蛋白H2AX 被迅速激活和磷酸化，生成γ-H2AX，過表達miR-22 通過促進γ-H2AX 表達顯著誘導(dǎo)乳腺癌凋亡，并提高其放射敏感性［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA PCAT1 顯著上調(diào)γ-H2AX 表達，增強T47D 細胞的放射敏感性。

lncRNA 通過多種機制、多途徑在腫瘤進展中發(fā)揮作用。對lncRNA PCAT1 和腫瘤相關(guān)研究分析發(fā)現(xiàn)，其機制多與調(diào)控miRNA 表達有關(guān)，如lncRNA PCAT1 靶向miR-149-5p 顯著促進結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲［15］。沉默lncRNA PCAT1 通過調(diào)控miR-128/GOLM1 增強宮頸癌細胞的放射敏感性［16］。本研究通過Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-329-3p 是lncRNA PCAT1 的潛在靶基因。進一步分析顯示，乳腺癌細胞中miR-329-3p 表達量顯著降低，過表達miR-329-3p 顯著下調(diào)CyclinD1 表達，上調(diào)Cleaved-caspase-3 和γ-H2AX 蛋白表達，抑制T47D 細胞活力，誘導(dǎo)細胞凋亡，并增加其放射敏感性，而抑制miR-329-3p 發(fā)揮相反作用，表明miR-329-3p 表達改變除參與乳腺癌細胞惡性生物學(xué)行為外，還參與其放療耐藥表型。與本研究發(fā)現(xiàn)類似，Wang 等［17］證實抑制lncRNA X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物(XIST)通過上調(diào)miR-329-3p 表達顯著增加膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性，抑制細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。雙熒光素酶實驗證實lncRNA PCAT1 直接靶向miR-329-3p，在T47D 細胞中miR-329-3p 表達受到lncRNA PCAT1 的負性調(diào)控，提示乳腺癌中可能存在lncRNA PCAT1/miR-329-3p 調(diào)控途徑。已有研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路異常激活在乳腺癌發(fā)生和進展中具有促進作用，包括促進細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成和化療耐藥［18-19］。lncRNA PCAT-1 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進急性髓系白血病細胞惡化［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA PCAT-1 表達顯著抑制Wnt/β-catenin 信號通路活化，而抑制miR-329-3p 表達則激活Wnt/βcatenin 信號通路，且抑制miR-329-3p 表達還可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA PCAT-1 表達對T47D 細胞增殖、凋亡、放療敏感性以及Wnt/β-catenin 信號通路活化的影響，這說明lncRNA PCAT-1 可能靶向miR-329-3p 調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路進而影響T47D 細胞增殖、凋亡和放療敏感性。

綜上，乳腺癌細胞中l(wèi)ncRNA PCAT1 表達增加，干擾lncRNA PCAT1 可抑制乳腺癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，增加細胞放射敏感性，其機制可能與靶向miR-329-3p 抑制Wnt/β-Catenin 信號通路相關(guān)。因此，lncRNA PCAT1/miR-329-3p/Wnt/β-Catenin 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能是乳腺癌有效放療增敏靶點。