王辰元，王 釩，徐 靜，李文靜，張秉乾，冉隆賢，b，甄志先，b

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

葡萄嫩枝扦插是一種以夏季修剪下來的半木質(zhì)化的葡萄新梢為扦插材料進(jìn)行扦插繁殖的重要育苗方法，利用夏季枝量大、氣溫高、生長快的有利條件，可以達(dá)到廢物利用、快速育苗的目的[1]。采用這一技術(shù)繁育苗木，成本低廉，操作簡單，扦插成活率高，繁育速度快，能滿足生產(chǎn)中對(duì)苗木的大量需求，可為葡萄高產(chǎn)提供有力的保障[2]。但是，長期采用扦插繁殖的方法，容易造成病原菌隨著繁殖材料而遷移和擴(kuò)散等問題，特別是在利于病害發(fā)生的環(huán)境條件和管理水平低下的情況下，會(huì)很快導(dǎo)致病害的發(fā)生，造成重大損失。目前，生產(chǎn)中主要使用化學(xué)藥劑對(duì)葡萄苗木、種條進(jìn)行消毒處理，然而化學(xué)藥劑的長期使用，不僅會(huì)使植物產(chǎn)生抗藥性，更會(huì)導(dǎo)致環(huán)境的污染。采摘后的新鮮水果會(huì)遭到一些包括真菌及細(xì)菌在內(nèi)的有害生物的危害，而葡萄鮮品上市期比較短，且葡萄的貯藏技術(shù)還不太成熟，葡萄的病害直接影響其品質(zhì)和保鮮，故研究葡萄采摘后病害的種類及其防治方法，是葡萄保鮮貯藏、上架銷售、長途運(yùn)輸中亟待解決的重要問題[3-4]。因此，為了減少化學(xué)藥劑的使用，保證扦插繁殖成活率，提高葡萄果實(shí)的防霉保鮮效果，需要探索安全高效的除害技術(shù)。

輻照技術(shù)已被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域中，且產(chǎn)生了巨大效益，不僅能夠滅除病原菌和害蟲，還具有無化學(xué)殘留、全程無熱源和無添加劑的優(yōu)點(diǎn)，并能快速地進(jìn)行滲透性消毒。其中的60Co-γ 輻照技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要應(yīng)用于種子和枝條誘變、水果保鮮和糧食貯藏防蟲等方面[5-9]。趙藝璇等[10]對(duì)大花秋葵和錦葵的種子進(jìn)行輻照處理，結(jié)果證明，輻照能促進(jìn)種子萌發(fā)，同時(shí)能增強(qiáng)植物的抗逆性；陳春霞等[11]、何平等[12]、葉開玉等[13]采用γ 射線進(jìn)行輻照處理，結(jié)果都獲得了表現(xiàn)優(yōu)良的變異品種[11-13]。60Co-γ 輻照還是防治蟲害的有效手段，通過輻照谷類及其制品可以殺死害蟲及蟲卵或致其不育，因此，輻照可以解決因貯藏環(huán)境不適宜而導(dǎo)致的糧食蟲害問題。輻照也是果實(shí)保鮮的措施之一，低劑量的輻照能提高植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低其丙二醛（MDA）含量，有利于植物的正常生長代謝[14]。石彬等[15]、楊俊麗等[16]分別用低劑量的60Co-γ 輻照獼猴桃、草莓，均能延長果實(shí)的貯藏期，且對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響都較小。王秋芳等[17]的研究結(jié)果表明，1 000 Gy劑量以下的電子束輻照對(duì)巨峰葡萄的品質(zhì)無影響，劑量為700 Gy 的輻照可以使葡萄果實(shí)在貯藏初期的抗氧化能力增強(qiáng)，從而能延緩果實(shí)的衰老。關(guān)文強(qiáng)等[18]、Witbooi 等[19]、康芬芬等[20]采用60Co-γ輻照對(duì)葡萄進(jìn)行保鮮處理，但他們在所用輻照的劑量和試驗(yàn)結(jié)果方面均存在較大差異，因此，輻照技術(shù)對(duì)于葡萄主要病原真菌的抑制效果仍需深入研究。為此，本研究分別以巨峰葡萄1年生嫩枝和果實(shí)為試材，采用不同劑量的60Co-γ 輻照處理進(jìn)行試驗(yàn)，分析了60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄嫩枝和果實(shí)上主要病原真菌的抑制作用，旨在探尋一種新的除菌方法，從而為輻照除菌技術(shù)的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的植物材料為巨峰葡萄1年生嫩枝和果實(shí)，均采自河北省保定市滿城區(qū)南辛莊村葡萄園。

供試的菌種分別為葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea、葡萄潰瘍病菌Botryosphaeriasp.和葡萄白腐病菌Coniella diplodiella，試驗(yàn)所用菌種均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

試驗(yàn)所用60Co-γ 輻照的鈷源由北京大學(xué)技物樓鈷源實(shí)驗(yàn)室提供，鈷源的輻照劑量率為30 Gy/min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輻照處理對(duì)葡萄3 種病原真菌的影響試驗(yàn)

輻照對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)：配制濃度為105個(gè)/mL 的葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌孢子懸浮液，置于無菌離心管中，進(jìn)行劑量分別為40、100、600、1 000、2 000 Gy的60Co-γ 輻照，每個(gè)菌株的輻照各設(shè)3 次重復(fù)，以不進(jìn)行輻照的為對(duì)照。輻照后用移液槍吸取100 μL的孢子懸浮液均勻地涂布于PDA 平板上，于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，并計(jì)算分生孢子萌發(fā)率。

輻照對(duì)病原菌菌絲生長的影響試驗(yàn)：將葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌分別接種至PDA 平板上，于25 ℃的溫度條件下培養(yǎng)5 d 后進(jìn)行60Co-γ 輻照，輻照劑量分別設(shè)為40、100、600、1 000、2 000 Gy，每個(gè)菌株的輻照各設(shè)3 次重復(fù)，以不進(jìn)行輻照的為對(duì)照。將輻照過的菌株，取同樣大小的菌餅接種至新的PDA 平板上，在25 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，觀察并記錄其生長直徑。

1.2.2 輻照處理對(duì)葡萄嫩枝扦插成活率的影響試驗(yàn)

從田間采取健康的1年生葡萄嫩枝，去除頂端部分，保留1 ～2 片半葉，上切口距離第1個(gè)芽的上方1 cm 左右平剪并封蠟，下切口在盡量靠近葉柄基部斜切，制成長度為10 ～15 cm 的插條。將處理好的枝條置于劑量分別為40、100、600 Gy 的60Co-γ 射線下輻照，每個(gè)處理各設(shè)3 次重復(fù)，每次重復(fù)各處理15個(gè)枝條，以未作輻照的枝條為對(duì)照。將輻照過的枝條浸泡于生根粉溶液后扦插，保持適宜的溫度、濕度和光照，觀察并記錄枝條成活情況，以確定60Co-γ 輻照葡萄嫩枝的適宜強(qiáng)度與時(shí)間。

1.2.3 輻照處理對(duì)葡萄嫩枝上病原真菌的抑制作用的觀測

選擇長勢一致、健壯的葡萄綠枝條，剪去枝條上的葉片，修剪成10 ～15 cm 的小段，枝條剪口以石蠟封固。用75%的酒精對(duì)枝條表面進(jìn)行消毒后再用無菌水沖洗干凈，然后在葡萄枝條中部進(jìn)行刺傷處理，使用打孔器在葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌的PDA 平板上打取菌餅，將其接種于枝條刺傷部位，以空白菌餅為對(duì)照，用保鮮膜包扎好，然后進(jìn)行保濕培養(yǎng)，培養(yǎng)第7 天將發(fā)病枝條置于劑量分別為40、100、600 Gy的60Co-γ 射線下輻照，以不作輻照的為對(duì)照，每個(gè)處理各輻照10個(gè)枝條，繼續(xù)培養(yǎng)5 d 后記錄病斑直徑，計(jì)算病斑面積。

1.2.4 輻照處理對(duì)葡萄果實(shí)病原真菌的抑制作用的觀測

選取成熟度一致、大小均勻、無病蟲危害的葡萄果實(shí)，經(jīng)75%的酒精消毒后再用無菌水沖洗干凈。使用滅菌接種針在果實(shí)表面等距離地扎3個(gè)小孔，再用移液槍吸取濃度為105個(gè)/mL 的葡萄灰霉病菌和葡萄白腐病菌的孢子懸浮液接種在傷口上[21]，每種孢子懸浮液各20 μL，于25 ℃的溫度條件下培養(yǎng)20 h，待病菌萌發(fā)侵入后才進(jìn)行60Co-γ輻照，其劑量分別設(shè)為100、600、1 000 Gy，以接種病菌但未進(jìn)行60Co-γ 輻照的果實(shí)為對(duì)照，每個(gè)處理各用果實(shí)10個(gè)，重復(fù)3 次。輻照后仍然將其放在25 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察并記錄各處理下果實(shí)的發(fā)病情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

使用Microsoft Excel（Office 2010）軟件整理原始數(shù)據(jù)、繪制表格；使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照處理對(duì)葡萄3 種病原真菌的影響

2.1.1 輻照處理對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的影響

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的影響情況如圖1所示。由圖1 可知，當(dāng)輻照劑量大于600 Gy 時(shí)，3 種病原真菌孢子的萌發(fā)均受到顯著的抑制；其中，60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄灰霉病菌的孢子具有明顯的致死作用。以劑量分別為40 和100 Gy 的60Co-γ 輻照處理后，葡萄灰霉病病菌孢子的萌發(fā)率與對(duì)照處理的無顯著性差異；劑量為600 Gy 的輻照處理可抑制葡萄灰霉病菌94.0% 的孢子的萌發(fā)；以劑量在1 000 Gy 及以上的輻照處理后，葡萄灰霉病病菌孢子萌發(fā)率最低，僅為0.7%。

圖1 不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄3 種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of 60Co-γ radiation at different doses on spore germination of three grape pathogenic fungi

以低劑量（40 和100 Gy）的60Co-γ 射線輻照葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病病菌孢子懸浮液后，其孢子萌發(fā)率與對(duì)照處理的均無顯著性差異；當(dāng)輻照劑量高于600 Gy 時(shí)，此兩種病菌孢子的萌發(fā)率均開始顯著下降；在劑量為2 000 Gy 的輻照處理下，葡萄白腐病菌孢子的萌發(fā)率最低（僅為1.9%），其抑制率高達(dá)97.4%，而葡萄潰瘍病病菌孢子的萌發(fā)率也是最低（為5.9%）的，其抑制率為92.5%。

2.1.2 輻照處理對(duì)病原真菌菌絲生長的影響

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)3 種病原真菌菌絲生長的影響情況見表1。表1 表明，不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)不同病菌生長的抑制作用有所不同，低劑量（40 Gy）的輻照處理對(duì)葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌和葡萄潰瘍病菌的菌絲均有一定的刺激與促進(jìn)生長的作用，當(dāng)劑量達(dá)到一定強(qiáng)度時(shí)，60Co-γ 輻照處理對(duì)病菌菌絲的生長才有抑制作用。其中，葡萄潰瘍病菌對(duì)60Co-γ 的輻照處理最敏感，劑量為100 Gy 的60Co-γ 輻照處理對(duì)其就有顯著的抑制作用，而劑量在1 000 Gy 以上的60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄灰霉病菌絲才有抑制作用，劑量為2 000 Gy 的60Co-γ 輻照處理可使得葡萄灰霉病菌、葡萄潰瘍病病菌都不能生長，葡萄灰霉病菌菌絲體由白色變成黃褐色，接種至新的培養(yǎng)基上其不能繼續(xù)生長，該劑量對(duì)葡萄白腐病菌菌絲有顯著的抑制作用，卻沒有殺滅的效果。

表1 不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)3 種病原真菌菌絲生長的影響?Table 1 Inhibition effects of different doses of 60Co-γ on mycelial growth of three fungal pathogens

2.2 輻照處理對(duì)嫩枝扦插成活率的影響

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄嫩枝扦插成活率的影響情況如圖2所示。由圖2 可知，不同劑量的60Co-γ 輻照處理的葡萄枝條成活率不同。隨著輻照劑量的加大，其成活率先上升后降低，當(dāng)輻照劑量為100 Gy 時(shí)，葡萄枝條的成活率達(dá)到了最大值，為48.9%；劑量為600 Gy 的輻照處理對(duì)枝條成活有一定的抑制作用，但該處理的成活率與對(duì)照處理的無顯著性差異。

圖2 不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄嫩枝扦插成活率的影響Fig.2 Survival rates of grape cuttings after 60Co-γ radiation at different doses

2.3 輻照處理對(duì)葡萄嫩枝真菌病害的抑制效果

對(duì)發(fā)病嫩枝進(jìn)行不同劑量的60Co-γ 輻照處理后統(tǒng)計(jì)其病斑擴(kuò)展面積，結(jié)果如圖3所示。由圖3A 可知，低劑量（40 Gy）的輻照處理對(duì)葡萄灰霉病病斑擴(kuò)展的抑制作用不明顯，劑量分別為100和600 Gy 的60Co-γ 輻照處理下葡萄灰霉病病斑的擴(kuò)展面積與對(duì)照處理的相比均有顯著性差異；葡萄白腐病病斑擴(kuò)展面積與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即隨著輻照劑量的加大病斑擴(kuò)展面積逐漸減小，劑量分別為100 和600 Gy 的60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄白腐病病斑擴(kuò)展均有顯著的抑制作用，而低劑量（40 Gy）的輻照處理對(duì)其抑制作用不明顯（圖3B）；由圖3C 可知，劑量為40 Gy 及以上的輻照處理對(duì)葡萄潰瘍病病斑的抑制效果均顯著。

圖3 不同劑量的60Co-γ 輻照對(duì)葡萄嫩枝病斑擴(kuò)展的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of 60Co-γ radiation at different doses on lesion expansion of grape cuttings

2.4 輻照處理對(duì)葡萄果實(shí)真菌病害的抑制作用

不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄果實(shí)真菌病害的影響情況如圖4所示。由圖4A 可知，輻照處理2 d 后，各處理組果實(shí)的葡萄灰霉病發(fā)病率均顯著低于對(duì)照處理的，其中，劑量分別為600 與1 000 Gy 的輻照處理的效果均較好，果實(shí)的葡萄灰霉病發(fā)病率分別僅有10.0%和3.3%；輻照處理4 和6 d 后，劑量分別為600 與1 000 Gy 的輻照處理組果實(shí)的葡萄灰霉病發(fā)病率均顯著低于對(duì)照組的，以劑量為100 Gy 的輻照處理6 d 后果實(shí)的葡萄灰霉病發(fā)病率與對(duì)照組的無顯著差異；輻照處理8 d 后，果實(shí)的葡萄灰霉病發(fā)病率持續(xù)增加，劑量為600 Gy 的輻照處理果實(shí)的葡萄灰霉病發(fā)病率與對(duì)照組的無顯著差異；輻照處理10 d 后，雖然1 000 Gy的輻照處理組與對(duì)照組之間仍有顯著差異，但葡萄果實(shí)幾乎全部發(fā)病。因此，60Co-γ 輻照處理果實(shí)只能使葡萄灰霉病的發(fā)生時(shí)間延后4 ～6 d，仍不能完全控制葡萄果實(shí)灰霉病的發(fā)生。

由圖4B 可知，劑量為100 Gy 的輻照處理對(duì)葡萄果實(shí)白腐病的抑制效果不明顯，葡萄果實(shí)白腐病的發(fā)病率雖略低于對(duì)照組的，但其差異沒有達(dá)到顯著水平；劑量分別為600 與1 000 Gy 的輻照處理組果實(shí)的葡萄白腐病發(fā)病率，輻照處理2 d后的均顯著低于對(duì)照組的，而輻照處理4 d 后的發(fā)病率與對(duì)照組的無顯著差異，其中劑量為1 000 Gy的輻照處理對(duì)葡萄果實(shí)的白腐病的抑制效果最好，輻照處理2 d 后白腐病的發(fā)病率為60.0%。因此，一旦葡萄白腐病菌大量侵入傷口，60Co-γ 輻照處理也不能有效阻止病菌在葡萄果實(shí)組織中擴(kuò)展，但可以推遲葡萄果實(shí)白腐病在貯藏期間的發(fā)病時(shí)間。

圖4 不同劑量的60Co-γ 輻照對(duì)葡萄果實(shí)病原真菌的抑制效果Fig.4 Inhibition effects on fungal pathogens of grape after 60Co-γ radiation at different doses

3 討論與結(jié)論

60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄3 種真菌病害病原菌的孢子和菌絲都有明顯的抑制甚至致死作用。輻照其孢子時(shí)，劑量大于600 Gy 的輻照處理開始有明顯的抑制效果，并且隨著輻照劑量的加大其對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果越明顯；當(dāng)輻照劑量為2 000 Gy時(shí)，3 種病菌的孢子幾乎都未萌發(fā)。輻照其菌絲體時(shí)，對(duì)60Co-γ 輻照處理的敏感性，菌絲比孢子低；2 000 Gy 的輻照劑量可以阻止葡萄灰霉病菌和葡萄潰瘍病菌的生長，該劑量對(duì)葡萄白腐病菌的菌絲雖有顯著的抑制作用，卻沒有殺滅的效果，對(duì)葡萄白腐病菌菌絲的抑制可能需要更大劑量的60Co-γ 輻照。

在以60Co-γ 輻照處理抑制葡萄嫩枝3 種真菌病害的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，最佳輻照劑量為600 Gy。經(jīng)60Co-γ 輻照處理后，葡萄嫩枝上3 種病害病斑的擴(kuò)展面積均小于對(duì)照組的，不同劑量的60Co-γ 輻照處理對(duì)葡萄灰霉病、葡萄白腐病和葡萄潰瘍病這3 種病菌的病斑在葡萄嫩枝上的擴(kuò)展均有一定的抑制作用，而且隨著輻照劑量的加大，病斑的擴(kuò)展面積顯著減小，其中劑量在100 Gy 以上的輻照處理對(duì)3 種病菌的抑制作用均顯著，而以劑量為600 Gy的60Co-γ 輻照處理后病斑擴(kuò)展的面積最小，說明其抑制效果最好，劑量為600 Gy 的輻照處理對(duì)葡萄灰霉病、葡萄白腐病、葡萄潰瘍病的抑制率分別為84.5%、75.9%、76.9%，與對(duì)照組的相比，劑量為600 Gy 的輻照處理對(duì)葡萄嫩枝的成活率無影響。因此建議，嫩枝扦插繁殖時(shí)宜采用劑量為600 Gy 的60Co-γ 輻照處理以替代傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑殺菌方式，從而減少化學(xué)藥劑的使用量。

通過在葡萄果實(shí)上刺傷接種葡萄灰霉病菌和葡萄白腐病菌，模擬在運(yùn)輸過程中有擠壓裂果的情況下病菌對(duì)果實(shí)的侵染狀況，經(jīng)過60Co-γ 輻照處理后，在處理前期輻照能明顯地抑制葡萄灰霉病和葡萄白腐病的發(fā)生，表明60Co-γ 輻照處理可使葡萄果實(shí)在貯藏期間病害發(fā)生的時(shí)間推遲，從而達(dá)到延長葡萄果實(shí)貨架期的目的。Witbooi 等[19]的研究結(jié)果表明，當(dāng)劑量在900 Gy 及以下時(shí)，輻照處理對(duì)葡萄品質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生不良影響。但是，目前國內(nèi)尚未有關(guān)于60Co-γ 輻照處理對(duì)巨峰葡萄品質(zhì)影響的研究報(bào)道，因此，采用劑量為600 Gy 的輻照處理是否能真正預(yù)防葡萄果實(shí)貯藏期病害的發(fā)生，對(duì)此尚待進(jìn)一步研究。

60Co-γ 射線能量大，其滅菌效果比采用蒸汽滅菌等普通滅菌方法的滅菌效果更好，其滅菌更徹底。目前，有關(guān)60Co-γ 輻照葡萄枝條的研究主要集中在探討其誘變及性狀變異等方面，有關(guān)60Co-γ輻照處理對(duì)枝條萌芽率、物候期及新梢生長的影響的研究也有報(bào)道，而有關(guān)60Co-γ 輻照處理對(duì)其病害抑制作用的研究卻鮮見報(bào)道[22]。同時(shí)，葡萄保鮮技術(shù)中的冷藏和氣調(diào)保鮮也都有抑制采后病原菌的作用，這些技術(shù)各具特點(diǎn)，也都有局限性，只有配合使用輻照保鮮技術(shù)與其他保鮮技術(shù)，才可產(chǎn)生良好作用，降低輻照劑量，減少輻照成本，提高保鮮效果，促進(jìn)水果輻照保鮮技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用[23-24]。

本研究結(jié)果表明，以劑量為600 Gy 的60Co-γ輻照葡萄嫩枝，能顯著抑制其病斑的擴(kuò)展，且對(duì)其嫩枝扦插成活率也無明顯的不良影響。此劑量亦能有效抑制其枝條上攜帶的病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長。60Co-γ 輻照葡萄果實(shí)的適宜劑量為600 Gy，此劑量的輻照處理可使葡萄果實(shí)貯藏期病害發(fā)生的時(shí)間推遲4 ～6 d。但是，目前該輻照技術(shù)仍局限于實(shí)驗(yàn)室的研究中，還沒有大面積地應(yīng)用到生產(chǎn)中，而且，60Co-γ 輻照處理對(duì)巨峰葡萄品質(zhì)的影響情況尚不清楚，因此，今后仍需在此劑量的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入的研究，最終達(dá)到在不影響植株正常生長和果實(shí)品質(zhì)的前提下最大限度地抑制甚至殺死病原真菌的目的。