李夢莎，周 琳，王 化，朱良玉，何丹嬈，周麗萍

（黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040）

藍(lán)靛果Lonicera caeruleaL.是忍冬科忍冬屬藍(lán)果忍冬的變種，為落葉灌木，又稱為羊奶子果、山茄子果、黑瞎子果等[1-3]。藍(lán)靛果漿果（新鮮或者冷藏）被審定為新型食品。藍(lán)靛果具有能抵抗寒冷、蟲害和土壤酸化的特點(diǎn)。其在波蘭、斯洛文尼亞、捷克共和國和斯洛伐克等歐洲國家和中國的東北地區(qū)、內(nèi)蒙古、河北、山西、寧夏都有廣泛的種植[4-6]。近幾年，有關(guān)藍(lán)靛果的研究內(nèi)容主要集中于抗癌、抗炎、抗氧化活性等方面[5-8]。藍(lán)靛果的這些保健功用與其果實中含有的花色苷類、黃酮類、多酚類等植物化學(xué)成分有關(guān)，而藍(lán)靛果中植物化合物的含量和功能特性與品種、基因型和采收地點(diǎn)均密切相關(guān)[9-10]。

目前，如何從食物源中尋找抗氧化活性強(qiáng)的物質(zhì)已成為相關(guān)研究的重要主題，因為含有抗氧化劑的漿果對癌癥、腫瘤和炎癥性疾病具有很強(qiáng)的抑制功效[11-13]。而有關(guān)研究結(jié)果表明，藍(lán)靛果漿果是自由基清除劑的優(yōu)質(zhì)來源物；Halvorsen 等[14]研究認(rèn)為，黑莓、草莓、覆盆子和藍(lán)莓都是抗氧化能力極強(qiáng)的漿果；Rupasinghe 等[15]在一項體外試驗中證明，藍(lán)靛果的抗氧化活性通常比草莓、藍(lán)莓或黑莓的更強(qiáng)。在酚類化合物中，花色苷作為抗氧化劑，能夠有效減輕紫外線輻射、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病帶來的負(fù)面影響，且對肝臟和心臟具有保護(hù)作用。此外，Zhao 等[16]的研究結(jié)果表明，抗氧化活性與生物活性化合物的提取方式密切相關(guān)，甲醇提取物比乙酸乙酯或二氯甲烷提取物具有更強(qiáng)的抗氧化活性。目前，國內(nèi)外關(guān)于藍(lán)莓、篤斯越桔、蔓越莓等漿果中的花色苷的研究報道很多，但是，關(guān)于藍(lán)靛果中花色苷抗氧化活性的研究報道卻較少[17-18]?！{(lán)精靈’Lonicera caerulea是新近培育出的藍(lán)靛果品種，近幾年其栽培面積不斷擴(kuò)大，已形成規(guī)?；纳a(chǎn)格局，對其分離純化及生理功能展開研究，可為花色苷產(chǎn)品的深加工與高值化利用提供理論參考依據(jù)，以推動其產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[19-22]。為此，本研究以藍(lán)靛果為原料，對色譜柱層析分離純化藍(lán)靛果花色苷的工藝條件進(jìn)行研究，并對分離純化前后不同花色苷組分抗氧化活性進(jìn)行比較分析，以期獲得純度較高、抗氧化活性較強(qiáng)的花色苷類化合物，為藍(lán)靛果資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試原料為采摘于哈爾濱市賓縣河西村浩北藍(lán)莓基地的藍(lán)靛果栽培品種‘藍(lán)精靈’的成熟果實。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的制備

參照有關(guān)文獻(xiàn)[23]中介紹的方法制備花色苷的提取物，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取劑，采用超聲輔助的方法進(jìn)行提取。

1.2.2 花色苷含量的測定

采用高效液相色譜法測定提取物和純化后藍(lán)靛果各組分中的花色苷，以矢車菊-3-O 葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定。

1.2.3 固定相介質(zhì)的選擇

從XDA 系列和LX 系列樹脂中選用適用于多酚類物質(zhì)分離的XDA-7、XDA-4、LX-28 和LX-17 這4 種類型的樹脂，各種樹脂的物理參數(shù)詳見表1，并對各種樹脂進(jìn)行活化處理。

表1 4 種類型大孔吸附樹脂的物理參數(shù)Table 1 Physical parameters of four types of macroporous resins

1.2.4 靜態(tài)吸附與解析試驗設(shè)計

分別稱取已活化好的4 種樹脂，每種樹脂各10.00 g，將其分別置于150 mL 的具塞錐形瓶中，然后分別加入在525 nm 處其吸光值（A）為1.000的藍(lán)靛果花色苷樣品液100 mL。將錐形瓶放入恒溫振蕩器中，于室溫、轉(zhuǎn)速為100 r·min-1的條件下振蕩吸附。在振蕩開始后，每間隔0.5 h 量取2.5 mL 的花色苷樣品液，在525 nm 下測定吸光值（A0），直至樹脂顆粒達(dá)到吸附飽和狀態(tài)、加入的藍(lán)靛果花色苷提取溶液在525 nm 處的吸光值（A1）保持不再下降為止。然后濾除瓶中花色苷液體，再加入70%的乙醇水溶液100 mL 進(jìn)行解析試驗；在解析開始后，每間隔0.5 h 量取花色苷樣品液2.5 mL，在525 nm 下測定吸光值（A2），直至吸光值無顯著增加為止，這才完成靜態(tài)解析試驗。吸附率（adsorption rate，Ra）和解析率（resolution rate，Rr）的計算公式分別如下：

上列2個公式中：Ra表示吸附率，Rr表示解析率；A0表示花色苷原液的吸光值，A1表示吸附后濾液的吸光值，A2表示解析后濾液吸光值；V0表示花色苷原液的體積，V1表示吸附后濾液的體積，V2表示解析后濾液的體積。

1.2.5 動態(tài)洗脫試驗設(shè)計

將選出的比較好的樹脂進(jìn)行動態(tài)洗脫試驗。采用濕法裝柱，柱高30 cm，直徑1 cm，將樹脂裝至20 cm 高處后靜置24 h 進(jìn)行平衡，然后加入質(zhì)量濃度為25 μg·mL-1的花色苷提取液3.0 mL，靜止吸附2 h 后，先用3 BV 的蒸餾水洗脫，然后用3 BV 的70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，收集3 mL 為1 管，在525 nm 處測定吸光值，繪制動態(tài)洗脫曲線。

1.2.6 流動相優(yōu)化試驗設(shè)計

參照前述裝柱方法，以乙醇水溶液為洗脫劑，從其濃度為40%開始洗脫，以10%為一個濃度梯度值，待其濃度為90%時收集洗脫液，研究不同濃度乙醇的洗脫效果。

1.2.7 抗氧化指標(biāo)的測定方法

參照試劑盒上的方法和步驟測定總抗氧化能力；參照有關(guān)文獻(xiàn)[24]中介紹的方法測定藍(lán)靛果花色苷對羥自由基的清除能力；按照包怡紅等[25]采用的方法測定藍(lán)靛果花色苷對DPPH 自由基的清除能力。將純化前后的樣品溶液稀釋至相同濃度進(jìn)行測定。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics（Version 19）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，使用Excel 軟件進(jìn)行分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附和解析結(jié)果

4 種類型大孔樹脂對藍(lán)靛果花色苷的吸附率與解析率的測定結(jié)果見表2。由表2 可知，XDA-7與LX-28 型大孔樹脂對藍(lán)靛果花色苷的吸附率均較高，分別達(dá)到83.52%和76.31%；XDA-7 與LX-28 型大孔樹脂對藍(lán)靛果花色苷的解析率也都較高，都可達(dá)到75%以上。XDA-7 型大孔樹脂對藍(lán)靛果花色苷的吸附率、解析率分別為83.52%、85.35%，均為最高值，且其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。這一測定結(jié)果說明，XDA-7 型大孔樹脂為純化藍(lán)靛果的最佳樹脂。

表2 4 種類型大孔樹脂的吸附率與解析率Table 2 Adsorption rate and desorption rate of four types of macroporous resin %

2.2 動態(tài)洗脫結(jié)果

花色苷的靜態(tài)吸附曲線如圖1所示。由圖1可知，XDA-7 型大孔樹脂在吸附30 min 后基本達(dá)到吸附平衡?；ㄉ盏慕馕銮€如圖2所示。由圖2 可知，乙醇溶液對XDA-7 型介質(zhì)有較好的解析能力，解析90 min 基本達(dá)到解析平衡。繪制的花色苷動態(tài)洗脫曲線如圖3所示。由圖3 可知，以70%的乙醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，當(dāng)洗脫體積為15 mL 時，可以獲得較純的藍(lán)靛果花色苷解析液；而當(dāng)洗脫液體積大于15 mL 后，花色苷的質(zhì)量濃度開始下降。這一測定結(jié)果說明，15 mL 為最適的洗脫液體積。

圖1 花色苷的靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curve of the anthocyanin

圖2 花色苷的解析曲線Fig.2 Analytical curve of anthocyanin

圖3 固定相介質(zhì)對花色苷的動態(tài)洗脫圖Fig.3 Dynamic elution figure of the stationary phase medium for the anthocyanin

2.3 流動相介質(zhì)優(yōu)化研究結(jié)果

分別選取40%、50%、60%、70%、80% 和90%的乙醇水溶液作為流動相介質(zhì)，對已飽和吸附花色苷的XDA-7 型大孔樹脂介質(zhì)進(jìn)行解析，計算解析率，結(jié)果如圖4所示。由圖4 可知，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時，花色苷的解析率已達(dá)到82.5%；再繼續(xù)增加乙醇的體積分?jǐn)?shù)，其解析率與前者的差異并不大。因此，結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本分析確定，最佳流動相介質(zhì)為70%的乙醇水溶液。

圖4 流動相介質(zhì)的洗脫效果Fig.4 Elution effect of mobile phase medium

2.4 純化后花色苷的純度分析結(jié)果

經(jīng)過優(yōu)化純化條件對藍(lán)靛果花色苷粗提物進(jìn)行洗脫與純化，結(jié)果得到了藍(lán)靛果花色苷的4個組分，根據(jù)洗脫順序，將其分別命名為L1、L2、L3、L4，而將其粗提物命名為L0，花色苷各組分的純度如圖5所示。由圖5 可知，花色苷4個組分的純度均在20%以上，其中，L2組分的純度最高，達(dá)到了（45.91%±0.32%），與粗提物L(fēng)0 的純度（7.64%±0.26%）相比，L2 組分的純度提高了6 倍。各組分的純度由大到小依次為L2 ＞L3 ＞L1 ＞L4 ＞L0。

圖5 花色苷不同組分的純度Fig.5 The purity of anthocyanins in different components

2.5 藍(lán)靛果花色苷體外抗氧化能力的測定結(jié)果

2.5.1 藍(lán)靛果花色苷總抗氧化能力

藍(lán)靛果中含有多種生物活性物質(zhì)，其有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。一般情況下，總抗氧化能力表示待測樣品中所有抗氧化劑的抗氧化能力之和。藍(lán)靛果花色苷果實中的總抗氧化能力的測定結(jié)果如圖6所示。由圖6 可知，純化后藍(lán)靛果中花色苷各組分的總抗氧化能力均高于其粗提物的，說明純化有利于增強(qiáng)待測樣品的抗氧化能力?？寡趸瘎┏７譃樽柚剐涂寡趸瘎┖蛿噫溞涂寡趸瘎参矬w內(nèi)存在的花色苷類物質(zhì)一般屬于斷鏈型抗氧化劑，通過釋放活潑氫與自由基或氫離子或電子結(jié)合，轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的非自由基產(chǎn)物。純化后，由于極性的不同，除去了花色苷組分中的糖、蛋白質(zhì)等成分，使得花色苷等抗氧化組分的含量有所增加，從而增強(qiáng)了其抗氧化能力。純化后花色苷不同組分的總抗氧化能力不同，這可能與不同組分花色苷的結(jié)構(gòu)不同有直接關(guān)系。花色苷4 種組分的純化產(chǎn)物的總抗氧化能力隨著花色苷質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。其中，花色苷L2 組分的總抗氧化能力最強(qiáng)，當(dāng)花色苷的質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg·mL-1時，其總抗氧化能力為5.77 U·mL-1，花色苷L3、L1、L4 組分的總抗氧化能力依次次之。

圖6 藍(lán)靛果花色苷各組分的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of each component of L.caerulea anthocyanins

2.5.2 藍(lán)靛果花色苷清除羥自由基的能力

藍(lán)靛果花色苷各組分清除羥自由基能力的檢測結(jié)果如圖7所示。由圖7 可知，隨著藍(lán)靛果花色苷各純化組分質(zhì)量濃度的增大，花色苷大部分組分清除羥自由基的能力均增強(qiáng)。這一結(jié)果說明，藍(lán)靛果花色苷各純化組分的質(zhì)量濃度與其清除羥自由基能力之間呈現(xiàn)量效關(guān)系。清除羥自由基能力最強(qiáng)的是L2 組分，當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1時，其對羥自由基的清除率達(dá)到93%；其次是L1 組分的，其清除率達(dá)到91%；L3 和L4組分對羥自由基的清除率分別為80%與76%。

圖7 藍(lán)靛果花色苷各組分清除羥自由基能力的比較Fig.7 Comparison of scavenging ability of anthocyanins from L.caerulea to hydroxyl free radicals

2.5.3 藍(lán)靛果花色苷清除DPPH 自由基的能力

藍(lán)靛果花色苷清除DPPH 自由基能力的測定結(jié)果如圖8所示。由圖8 可知，當(dāng)花色苷的質(zhì)量濃度為0.2 ～0.8 mg·mL-1時，藍(lán)靛果花色苷清除DPPH 自由基的能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。這一結(jié)果說明，花色苷的質(zhì)量濃度與其清除羥自由基能力之間呈現(xiàn)量效關(guān)系。而當(dāng)其質(zhì)量濃度大于0.8 mg·mL-1時，花色苷L3、L4 組分清除DPPH 自由基的能力反而減弱。這一結(jié)果說明，花色苷的質(zhì)量濃度與其清除羥自由基能力之間存在一個動態(tài)平衡的狀態(tài)和量效的關(guān)系。

圖8 藍(lán)靛果花色苷不同組分清除DPPH 自由基能力的比較Fig.8 Comparison of scavenging ability of anthocyanins from L.caerulea to DPPH

2.5.4 藍(lán)靛果花色苷不同組分清除自由基能力的比較分析

半數(shù)抑制濃度即IC50值可以反映抗氧化劑對自由基的清除能力，IC50值越小，表明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)。計算IC50值（指自由基抑制率達(dá)到50%時花色苷的質(zhì)量濃度），比較分析不同抗氧化劑的IC50值的大小，有利于比較分析其抗氧化能力的強(qiáng)弱。藍(lán)靛果花色苷不同組分清除羥自由基、DPPH 自由基的IC50值的測定結(jié)果見表3。由表3 可知，藍(lán)靛果花色苷L2 組分清除羥自由基的IC50值最小，為0.358 mg·mL-1；而其粗提物L(fēng)0 清除羥自由基的IC50值最大，為0.715 mg·mL-1；不同組分清除羥自由基的IC50值從小到大的順序為L2 ＜L1 ＜L4 ＜L3 ＜L0。藍(lán)靛果花色苷L4 組分清除DPPH 自由基的IC50值最小，為0.510 mg·mL-1；而其粗提物L(fēng)0 清除DPPH自由基的IC50值最大，為0.726 mg·mL-1；不同組分清除DPPH 自由基的IC50值從小到大的順序為L4 ＜L2 ＜L3 ＜L1 ＜L0。

表3 藍(lán)靛果花色苷不同組分清除羥自由基、DPPH 自由基的IC50 值Table 3 IC50 value of hydroxyl free radicals and DPPH scavenging activity by anthocyanins in L.caerulea mg·mL-1

2.6 花色苷的純度與其體外抗氧化能力間的相關(guān)性分析

花色苷的純度與其體外抗氧化能力間的相關(guān)系數(shù)見表3。由表3 可知，花色苷的純度與其總抗氧化能力間呈顯著正相關(guān)；而與其清除羥自由基、DPPH 自由基的IC50值之間均呈負(fù)相關(guān)，但其相關(guān)性均不顯著（P＜0.05）。

表3 花色苷的純度與其總抗氧化能力、清除羥自由基和DPPH 自由基能力間的相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Correlation analysis between anthocyanin purity and total antioxidant capacity,scavenging ability of hydroxyl radicals and DPPH

藍(lán)靛果花色苷的純度與其各抗氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果如圖9所示。因為羥自由基清除率與IC50值之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此可以得出，隨著花色苷純度的逐漸增加，其清除自由基的能力逐漸降低?；ㄉ盏目偪寡趸芰εc其含量的線性關(guān)系方程中的R2值最高，為0.868，表明兩者間具有一定的相關(guān)性，這說明花色苷的總抗氧化能力隨著花色苷純度的增加而增加，因此花色苷的純度可以用作花色苷總抗氧化能力評價的參考指標(biāo)。

圖9 花色苷的純度與各抗氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果Fig.9 Correlation between anthocyanin purity and each antioxidant indexes

3 結(jié)論與討論

本研究采用大孔吸附樹脂提取并純化藍(lán)靛果中的花色苷，根據(jù)4 種大孔樹脂的含水率、吸附率、解析率的測定結(jié)果，篩選出的效果最優(yōu)的大孔樹脂為XDA-7 型樹脂；動態(tài)吸附和解析試驗結(jié)果均表明，XDA-7 型樹脂在吸附30 min 時達(dá)到平衡狀態(tài)；XDA-7 型樹脂在解析90 min 時達(dá)到平衡狀態(tài)；3 BV 為XDA-7 型樹脂最適的洗脫體積。純化后藍(lán)靛果各組分的抗氧化活性均優(yōu)于其純化前的；純化后藍(lán)靛果各組分的總抗氧化能力隨著其質(zhì)量濃度的增大均增強(qiáng)，其中，L2 組分的最強(qiáng)，且其總抗氧化能力與其質(zhì)量濃度之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系；清除羥自由基能力最強(qiáng)的組分是L2組分，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg·mL-1時，其對羥自由基的清除率達(dá)到93%；而其清除DPPH 自由基的IC50值，L2 組分的為0.531 mg·mL-1，L4 組分的為0.510 mg·mL-1，前者略低于后者。研究結(jié)果表明，純化可以大大增強(qiáng)花色苷的抗氧化能力，其中L2 組分的綜合抗氧化能力最強(qiáng)，這一結(jié)果可為后續(xù)的深入研究提供參考依據(jù)。

花色苷的純化，主要采用大孔樹脂柱層析法進(jìn)行。近幾年，常用的藍(lán)漿果花色苷純化樹脂類型分別有X-5 與AB-8 型。本研究篩選出了一種可適用于花色苷分離與純化的XDA-7 新型樹脂，其吸附率與解析率分別達(dá)到83.5%和85.3%。其吸附率與解析率均高的原因可能是，花色苷分子結(jié)構(gòu)中含有極性糖基和非極性母核，總體顯示出弱極性，而XDA-7 型樹脂亦為弱極性，因此其吸附率與解析率均高。

花色苷屬于生物類黃酮物質(zhì)，而黃酮物質(zhì)最主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。因此，花色苷整體純度越高，則有可能具有越高的抗氧化能力。本研究采用目前最常用的總抗氧化能力、清除DPPH 自由基能力、清除羥自由基能力等3 種評價指標(biāo)，分析評價了純化后不同組分的抗氧化活性，結(jié)果表明，花色苷純化產(chǎn)物的質(zhì)量濃度與其抗氧化能力之間呈現(xiàn)正相關(guān)性，這一分析結(jié)果證明了純化產(chǎn)物中的物質(zhì)大部分為具有抗氧化活性的黃酮類物質(zhì)。此外，純化產(chǎn)物的純度與其抗氧化活性之間也呈正相關(guān)，說明以這3 種指標(biāo)評價其抗氧化能力具有協(xié)同性與相似性，也進(jìn)一步驗證了結(jié)果的可靠性，這與有關(guān)研究者對其他小漿果[26]的研究結(jié)果一致。據(jù)此可根據(jù)黃酮含量的高低初步判定其種質(zhì)中抗氧化活性的強(qiáng)弱。但是，純化產(chǎn)物的純度雖然與其清除羥自由基、DPPH 自由基的IC50值之間均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，可其相關(guān)性均不顯著。因此說明，除純度外，花色苷的結(jié)構(gòu)對于其抗氧化能力同樣具有決定作用，所以如何進(jìn)一步鑒定純化產(chǎn)物中花色苷的結(jié)構(gòu)是后續(xù)相關(guān)研究中亟待解決的問題。胥萍等[27]的研究結(jié)果表明，D101 型大孔樹脂對血橙中的花色苷具有良好的吸附與解析能力，其對DPPH 自由基和ABTS 自由基都有一定的清除作用，且其作用隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)；包智影等[28]研究了以微生物法提取黃精多糖的工藝條件。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果均相似。

綜上所述，采用XDA-7 型樹脂純化藍(lán)靛果提取物，可以得到較高純度的花色苷，同時能獲得具有抗氧化活性強(qiáng)的花色苷組分和生物活性物質(zhì)。這一研究結(jié)果可為我們從經(jīng)濟(jì)林中獲取高價值的除木材以外的生物產(chǎn)品及經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品的高值化利用[29]奠定理論基礎(chǔ)。但是，本研究僅采用初步純化方法進(jìn)行試驗，在后續(xù)的相關(guān)研究中，可進(jìn)一步對篩選出的L2 組分進(jìn)行二次純化與結(jié)構(gòu)鑒定，以獲得純度更高、品質(zhì)更優(yōu)的花色苷產(chǎn)品。