吳林世，廖菊陽，劉 艷，李巧云，王 玲，張 娟，宋 胤，胡俊東

（1.湖南省植物園，湖南 長沙 410116；2.國家林業(yè)草原局 杜鵑工程技術研究中心，湖南 長沙 410116）

羊躑躅Rhododendron molle為杜鵑花科Ericaceae杜鵑花屬Rhododendron的落葉灌木，是湖南省新優(yōu)杜鵑屬鄉(xiāng)土植物。因其花色金黃，又名黃杜鵑；因其花有毒，亦名鬧羊花[1]。羊躑躅樹形優(yōu)美，花繁色艷，是園林露地栽培的優(yōu)良杜鵑花品種[2]。其不僅有良好的觀賞價值，還具有一定的藥用價值，可以用于祛風除濕，在治療跌打損傷、偏正頭痛、頑癬等方面也有一定的功效[3]。羊躑躅是一種微毒植物，可用于散瘀止痛，醫(yī)學上也用作鎮(zhèn)靜劑[4-5]。目前，有關羊躑躅的研究報道主要集中于化學成分鑒定、藥理作用、親緣關系、繁育等方面[6-8]，有關羊躑躅葉綠體基因組的研究報道較為鮮見，僅見其全基因測序結果的相關報道[9]。葉綠體、線粒體、細胞核并稱為三大遺傳系統(tǒng)，葉綠體含DNA 聚合酶和RNA 聚合酶，還具備獨立、完整的蛋白質合成系統(tǒng)，能自我完成RNA 的復制和轉錄。為了進一步補充完善羊躑躅基因組的序列特征，為羊躑躅新優(yōu)園藝品種的鑒定、不同地理分布的羊躑躅親緣關系分析提供參考，并為杜鵑屬植物的系統(tǒng)進化、遺傳多樣性分析、基因工程等提供參考，本研究中對羊躑躅葉綠體基因組進行測序組裝，根據(jù)已發(fā)表的杜鵑屬植物基因組學的研究結果，確定羊躑躅在系統(tǒng)進化過程中的地位。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羊躑躅葉片采自湖南省植物園（113°01′30″E，28°06′40″N[10]）。在8月中旬羊躑躅葉片生長旺盛時期，采集目標植株上健康無病蟲害的葉片作為供試材料，送往南京集思慧遠生物科技有限公司檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊躑躅葉綠體基因組測序

樣本經(jīng)硅膠干燥處理后送至實驗室，檢測前保存于-20 ℃低溫冰箱中。嚴格執(zhí)行Illumina 公司提供的葉綠體基因測序組裝操作標準，得到測序文庫，經(jīng)過質檢合格后，將文庫采用Illumina Novaseq 平臺進行測序。將經(jīng)測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）進行過濾，篩除接頭序列和低質量讀長（reads），獲得高質量的數(shù)據(jù)（clean data）。按照羊躑躅葉綠體基因組序列將所得的高質量數(shù)據(jù)進行序列組裝，獲得葉綠體序列組裝結果。

1.2.2 羊躑躅葉綠體基因組裝

1）葉綠體DNA 測序序列提取。使用bowtie2 v2.2.4（http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）的very-sensitive-local 模式，將所得序列與南京集思慧遠生物科技有限公司自建的數(shù)據(jù)庫進行比對，比對一致的測序序列即目標葉綠體DNA 序列。

2）葉綠體基因序列組裝。采用SPAdes v3.10.1（http://cab.spbu.ru/software/spades/）軟件組裝葉綠體基因組，k-mer 分別使用55、87、121，組裝不依賴參考基因組[11]。組裝過程中使用SPAdes、SSPACE v2.0、Gapfiller v2.1.1 等軟件得到完整的pseudo genome 序列，再次進行基因組校正，參考葉綠體結構將校正后的pseudo genome 進行坐標重排，得到目標基因組序列（環(huán)狀基因組序列）[12]。

1.2.3 羊躑躅葉綠體基因進化樹構建

為分析羊躑躅在物種系統(tǒng)進化中的位置，從NCBI 中下載已知的19個杜鵑花科植物葉綠體基因組和2個外群基因組。19個杜鵑花科植物分別是白珠樹屬Gaultheria的4個物種，越橘屬Vaccinium的5個物種，杜鵑屬的10個物種，其中羊躑躅和溪畔杜鵑R.rivulare（該物種葉綠體基因組序列未上傳NCBI）是自測物種；外群植物選擇的是榿葉樹科Clethraceae 榿葉樹屬Clethra的2個物種。將下載的葉綠體基因序列與羊躑躅葉綠體基因序列進行比對分析，構建杜鵑屬植物的進化樹。

2 結果與分析

2.1 羊躑躅葉綠體基因組的基本特征

將數(shù)據(jù)進行初步整理，得到羊躑躅葉綠體基因組圖譜（圖1）。由圖1 可見，經(jīng)測序組裝得到的基因組序列屬于典型的四段式結構，全長為197 877 bp。其中，大單拷貝區(qū)（LSC）長度為110 189 bp，小單拷貝區(qū)（SSC）長度為26 bp，反向重復區(qū)a（IRa）和反向重復區(qū)b（IRb）長度均為43 831 bp，GC 含量為36.00%。羊躑躅葉綠體共有146個基因。其中：92個基因為蛋白編碼基因，占全部基因數(shù)量的63.01%；其次是tRNA 基因，數(shù)量為46，占全部基因數(shù)量的31.51%；剩余的均為rRNA 基因，數(shù)量為8，占全部基因數(shù)量的5.48%。

圖1 羊躑躅葉綠體基因組圖譜Fig.1 Chloroplast genome map of R.molle

由圖1 可見：IR 區(qū)域有4個rRNA 基因，分別是rrn16S，rrn23S，rrn4.5S和rrn5S；IR 區(qū)域有9個tRNA 基因，分別是rnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-UAG、trnM-CAU、trnN-GUU、trnR-ACG、trnR-UCU、trnV-GAC；IR 區(qū)域還有4個蛋白質編碼基因，分別是rpl32、rps15、rps16、ycf4。這17個基因在IRa 區(qū)域和IRb 區(qū)域均存在，且除trnI-CAU基因外均為2個拷貝，trnI-CAU基因在IRa 區(qū)域和IRb 區(qū)域各出現(xiàn)2 次，存在2個拷貝，所以trnI-CAU基因為4個拷貝。

將測序結果進一步分析，對其中已知功能的基因進行分類，結果見表1。由表1 可知，根據(jù)功能可將其分為4 大類，分別是光合作用類、自我復制類、其他基因類以及未知功能基因類。光合作用類基因，按功能又可進一步分為6 小類，分別是光系統(tǒng)I 的亞基、光系統(tǒng)Ⅱ的亞基、細胞色素b/f 復合體的亞基、NADH-脫氫酶的亞基、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基和ATP 合酶亞基。在光合作用功能相關的基因中：種類最多的是光系統(tǒng)Ⅱ的亞基基因，有psbA、psbB、psbC等15 種；其次是NADH-脫氫酶的亞基基因，有ndhA、ndhB、ndhC等11 種；種類最少的是二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因，僅有rbcL。自我復制類基因可分為核糖體大亞基、核糖體小亞基、RNA 聚合酶亞基、rRNA 基因和tRNA 基因共5 小類，其中tRNA 基因數(shù)量最多，有46個基因。未知功能的基因有3個，分別是lhbA、ycf3、ycf4。

表1 羊躑躅葉綠體基因組編碼的基因?Table 1 Genes present in chloroplast genome of R.molle

羊躑躅葉綠體具內含子的基因長度見表2。由表2 可知，將已知基因功能進行分類后，有15個基因具有內含子。就分布位置來說，處于LSC區(qū)的有11個，處于IR 區(qū)的有4個。就內含子長度來說：自我復制功能相關trnk-uuu基因的內含子Ⅰ的長度最長，達2 499 bp，其次是未知功能基因ycf3，其內含子Ⅰ的長度為1 683 bp，核糖體小亞基rps12不具備內含子；具有內含子Ⅱ的僅rps12，其長度為538 bp。就外顯子長度來說，外顯子Ⅰ的平均長度為144 bp，外顯子Ⅱ的平均長度為248 bp，遠低于內含子Ⅰ的平均長度（966 bp），僅rps12具有外顯子Ⅲ，長度為114 bp。外顯子Ⅰ長度最長的是NADH-脫氫酶的亞基中的ndhB，長度為721 bp，該基因的外顯子Ⅱ長度也最長，為758 bp；外顯子Ⅰ長度最短的是細胞色素b/f 復合體的亞基中的petB和petD，長度僅為6 bp，外顯子Ⅱ長度最短的是核糖體小亞基rps12，長度為26 bp。

表2 羊躑躅葉綠體具內含子基因的長度Table 2 Gene length of introns in chloroplasts of R.molle bp

2.2 羊躑躅葉綠體基因組的密碼子偏好性

羊躑躅葉綠體基因組中密碼子組成見表3。由表3 可知，羊躑躅葉綠體基因組中共有22 312個密碼子，基因編碼區(qū)的序列占63.01%。葉綠體基因組中密碼子組成共20 種氨基酸。其中：亮氨酸數(shù)量最多，有2 456個（占11.01%），屬于編碼率最高的氨基酸；數(shù)量最少的是半胱氨酸，僅260個（占1.17%），屬于編碼率最低的氨基酸。

進一步對密碼子進行同義密碼子相對使用度（RSCU）分析，結果見表3。由表3 可知，有32個密碼子的RSCU 值大于1。其中：有16個氨基酸的密碼子以U 結尾，14個氨基酸的密碼子以A結尾，僅有2個氨基酸的密碼子以G 結尾?？梢?，氨基酸的密碼子以A 和U 結尾的較多，以C 和G 結尾的密碼子的出現(xiàn)頻率相對較低。同時，羊躑躅葉綠體中4個NCG 型（N 代表4 種堿基中的任一種）密碼子的RSCU 值較低，UCG、GCG、CCG、ACG 的RSCU 值分別為0.477 6、0.468 4、0.468 0、0.368 8。CG 含量的降低有利于抑制mRNA的降解，從而使蛋白產量增加。4個NUA 型密碼子具有較高的RSCU 值，UUA、GUA、AUA、CUA 的RSCU 值分別為2.152 2、1.400 8、0.910 2、0.786 6，說明羊躑躅可能屬于DNA 甲基化程度較高的物種[13]。

表3 羊躑躅葉綠體基因組中密碼子偏好性?Table 3 Relative synonymous codon usage(RSCU)in chloroplast genome of R.molle

2.3 羊躑躅葉綠體基因組的簡單重復序列（SSR）

在羊躑躅葉綠體基因組中已注釋的編碼序列之間，存在大量的間隔序列，這里面包含了大量的重復序列，這些序列的組成影響著染色體的空間構象，也影響了編碼序列的表達，因此研究重復序列對于分析基因調控網(wǎng)絡的功能具有重要意義。羊躑躅葉綠體基因組的簡單重復序列分析結果見表4。由表4 可知：在單核苷酸重復單元中以A/T 為主堿基，其數(shù)量占97.26%；在二核苷酸重復單元中，均為AT/AT，重復頻率集中在5 次；三堿基的主要重復基序為AAG/CTT，其數(shù)量占簡單重復序列位點重復單元總數(shù)量的11.48%，其次是AAT/ATT，占簡單重復序列位點重復單元總數(shù)量的9.24%；四堿基至六堿基重復出現(xiàn)頻率相對較低，均在0.6%以下。A/T 和AT/AT 占簡單重復序列位點重復單元總數(shù)量的64.70%，可見羊躑躅葉綠體基因組富含AT，與葉綠體簡單重復序列位點以AT 為主的理論吻合[14]。

表4 羊躑躅葉綠體基因組的簡單重復序列Table 4 Simple sequences repeat(SSR)analysis of chloroplast of R.molle

簡單重復序列的重復次數(shù)決定著重復堿基序列的長度，從而影響簡單重復序列的多態(tài)性[15]。羊躑躅葉綠體組簡單重復序列中從單堿基到六堿基各基元重復次數(shù)為5 ～10 的均有較多分布。單堿基重復次數(shù)為5 ～10 的較多，共179個，占簡單重復序列位點重復單元總數(shù)量的50.14%；雙堿基到六堿基重復次數(shù)為3 ～4 的較多，且隨著重復次數(shù)的增加，其簡單重復序列位點重復單元數(shù)量呈下降趨勢。

2.4 羊躑躅葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育

基于葉綠體基因組構建的羊躑躅系統(tǒng)進化樹如圖2所示。由圖2 可見，外群物種榿葉樹科的城口榿葉樹C.fargesii和云南榿葉樹C.delavayi與杜鵑花科物種的親緣關系較遠，杜鵑花科中杜鵑屬植物距離白珠樹屬和越橘屬距離一致。進一步分析杜鵑屬內物種的親緣關系發(fā)現(xiàn)，映山紅亞屬Subgen.Tsutsusi映山紅R.simsii、溪畔杜鵑與其他亞屬杜鵑距離較遠，杜鵑亞屬Subgen.Rhododendron的照山白R.micranthum、著生杜鵑R.kawakamii、大天頂杜鵑R.datiandingense、秀雅杜鵑R.concinnum4個物種的聚類距離與映山紅亞屬的聚類距離相近，羊躑躅亞屬Subgen.Pentanthera物種與常綠杜鵑亞屬Subgen.Hymenanthes的靈寶杜鵑R.henanensesubsp.lingbaoense、馬纓杜鵑R.delavayi、闊柄杜鵑R.platypodum3個物種的距離較近。進一步分析羊躑躅與常綠杜鵑亞屬這3個物種的遺傳距離發(fā)現(xiàn)，羊躑躅與靈寶杜鵑的遺傳距離為6.621×10-3cM，與馬纓杜鵑的遺傳距離為8.411×10-3cM，與闊柄杜鵑的遺傳距離為6.740×10-3cM。可見進化樹的聚類結果與經(jīng)典植物分類學研究結果是一致的，在植物分類學研究中羊躑躅是杜鵑屬羊躑躅亞屬五花藥組的唯一物種，在進化樹中羊躑躅單獨成組，聚類分析及遺傳距離分析結果表明，與羊躑躅親緣關系最近的物種是杜鵑屬常綠杜鵑亞屬的靈寶杜鵑。

圖2 基于葉綠體基因組構建的羊躑躅系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of R.molle based on chloroplast genome

3 結論與討論

葉綠體是光合作用的關鍵場所，能夠獨立自我完成RNA 的復制及轉錄。羊躑躅通過光合作用，可獲得其生長過程中必需的有機物及能量[16]。選擇葉綠體基因組進行測序組裝，來研究物種的親緣關系和種群進化關系，是因為其有獨特優(yōu)勢，測序組裝相對容易些[17]：與核基因組相比，其基因組較小，長度一般為120 ～160 kbp；與線粒體基因相比，其基因組結構相對保守。本試驗中對觀賞及藥用特性俱佳的羊躑躅的葉綠體基因組進行了測序，并獲得了較好的組裝和注釋結果。

測序組裝結果表明，羊躑躅葉綠體基因組具有高度保守的四段式結構，共注釋有146個基因，其中大部分基因為蛋白編碼基因，數(shù)量為92，tRNA 基因為46個，rRNA 基因為8個。羊躑躅葉綠體基因密碼子偏好A 和U 結尾，單核苷酸重復基序主要為A/T（97.26%）。在所選19個杜鵑屬物種和2個外群物種的系統(tǒng)進化樹中，羊躑躅單獨成組，與其關系最近的物種是靈寶杜鵑。

羊躑躅葉綠體基因組高度保守的四段式結構，與已經(jīng)報道的爵床科黃猄草屬菜頭腎Championella sarcorrhiza[18]、漆樹科鹽膚木屬鹽膚木Rhus chinensis[19]等綠色植物物種類似，均有1個大單拷貝區(qū)、1個小單拷貝區(qū)和2個反向重復區(qū)。羊躑躅葉綠體基因組的結構功能與菜頭腎、鹽膚木等物種的基因組也高度相似，基因表達主要集中在光合作用和自我復制的相關功能，與葉綠體的主要功能一致，即將光能轉變?yōu)榛瘜W能，將CO2和水轉變?yōu)樘恰?/p>

密碼子在基因組與蛋白質的聯(lián)系中發(fā)揮著重要作用。揭示密碼子偏好性的影響因素，能為基因組研究及其遺傳改良提供理論基礎[20]?；虻膲A基組成是密碼子偏好性的普遍影響因素，牛元等[21]認為影響密碼子偏好性形成的主要原因是選擇和堿基突變，密碼子的應用模式會影響基因的表達，進一步影響到密碼子偏好性。葉綠體基因組中的密碼子偏好性可揭示物種基因組的進化關系。羊躑躅葉綠體基因密碼子偏好A 和U 結尾，同義密碼子相對使用度分析結果也充分證明了這一觀點，與對蝶形花科香槐屬植物永椿香槐Cladrastis yunchunii[22]、馬兜鈴科細辛屬遼細辛Asarum heterotropoides[23]、薔薇科李屬大山櫻Prunus sargentii[24]的相關研究結果一致。

葉綠體DNA 中富含堿基A/T。羊躑躅葉綠體基因組的單核苷酸重復基序中A/T 占97.26%，橢圓葉花錨Halenia elliptica葉綠體基因組中單核苷酸重復序列中A/T 占94.53%[25]，菜頭腎葉綠體基因組的單核苷酸中A/T 占93.48%[18]；羊躑躅葉綠體DNA 簡單重復序列中A/T 和AT/AT 占簡單重復序列位點重復單元總數(shù)量的64.71%，橢圓葉花錨和菜頭腎葉綠體基因組的單核苷酸重復序列中其占比依次為61.90%、61.65%[18,25]。

在所選19個杜鵑屬物種和2個外群物種的系統(tǒng)進化樹中，羊躑躅單獨成組，這一結果與經(jīng)典植物分類學研究結果一致。羊躑躅與常綠杜鵑亞屬物種的親緣關系較近，與其關系最近的物種是靈寶杜鵑。在通過葉綠體基因序列構建得到的系統(tǒng)進化樹中，杜鵑花科不同屬、杜鵑屬不同組的物種被區(qū)分開來，這一結果可以為新優(yōu)杜鵑或者野外變異杜鵑的鑒定提供參考；根據(jù)葉綠體基因組的序列，可以定位其在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中的位置，分析與其親緣關系較近的杜鵑種，可為杜鵑屬植物的遺傳多樣性研究提供參考。

在研究過程中發(fā)現(xiàn)，羊躑躅野外分布地生境的破壞較為嚴重，羊躑躅野外群落較為稀少。國內羊躑躅的引種繁育主要依賴科研院所和花卉苗木培育企業(yè)。因地理位置、環(huán)境、栽培方式和管護的不同，羊躑躅產生了不同程度的變異，但目前僅選育出1個變異品種‘金躑躅’R.molle‘Jin Zhizhu’。目前，葉綠體基因測序組裝技術存在一定局限性：成本雖然有所降低，測序費用仍然偏高，難以使用該技術對經(jīng)濟價值相對較低的物種大規(guī)模開展研究工作；基因組序列組裝雖然不斷接近完成，但依然存在較多空白，而且基因組中的高重復、復雜區(qū)域依舊是基因組組裝面臨的重要問題；因其錯誤率高，需要得到大量測序數(shù)據(jù)進行糾正；基因組數(shù)據(jù)研究是其他功能研究的基礎，但表型性狀的遺傳機理十分復雜，如何有效開展多組學研究也是今后面臨的主要問題。為給羊躑躅的衍生新品種杜鵑的初期新品種鑒定提供參考，下一步將利用分子標記技術研究羊躑躅杜鵑花種質的遺傳多樣性，從基因組水平揭示其遺傳變異程度。