葉樹濤，顧光仕，李 煜，方 周，張 晶，楊金輝，鄭國華，陳 輝

（福建農(nóng)林大學 a.林學院；b.經(jīng)濟林研究所；c.園藝學院，福建 福州 350002）

錐栗Castanea henryi為殼斗科栗屬高大落葉喬木，雌雄異花同株，主要栽培于福建省北部和浙江省南部地區(qū)，是我國南方重要的木本糧食樹種。錐栗果實糯甜，富含淀粉、可溶性蛋白、蔗糖、可溶性糖等多種營養(yǎng)成分，同時含有17 種氨基酸，其中包括7 種人體必需氨基酸[1-3]，長期食用錐栗對于高血壓和心血管疾病的預防大有裨益[4]。

栗疫病是一種由栗屬樹種感染栗疫菌Cryphonectria parasitica后引起的真菌性病害[5]。栗疫菌危害的主要部位為樹干和主枝，當栗屬樹種被栗疫菌侵染后，首先其表皮形成褐色凹陷病斑，隨后腫脹或縱向龜裂，病害嚴重發(fā)生時整株會枯死[6-8]。栗疫病對植物物種有著毀滅性的危害。20世紀初，栗疫病在美國紐約美洲栗上被發(fā)現(xiàn)，在隨后的幾十年里，此病害在北美嚴重發(fā)生，致使美洲栗樹遭受滅頂之災[9]；從20世紀30年代開始，栗疫病在歐洲大面積蔓延，使得歐洲栗也被嚴重侵害[10]。20世紀90年代初期，我國在福建錐栗林中首次調(diào)查到疑似感染栗疫病的植株，經(jīng)鑒定后證實該植株的確被栗疫菌侵染[11]。目前，有關栗疫病的防治方法主要有噴施化學藥物（如波爾多液和多菌靈）、物理刮除染病組織、增施有機肥以減輕感病程度、篩選低毒力菌株等種方法，但是，采用這些防治措施還不能從根本上解決問題，只有選育出抗栗疫病的新品種才能從根本上防治栗疫菌病害[12-14]。美國科學家大力開展美洲栗的抗栗疫病育種工作，將對栗疫病具有較強抗性的中國板栗引種到美國，開展雜交育種工作，目前已取得了顯著成效[15]。有關板栗疫病的研究內(nèi)容目前主要集中在選擇育種和抗性基因定位等方面[16-17]。

錐栗作為我國特有的三大栗屬樹種之一，其經(jīng)濟價值與營養(yǎng)價值均極高。栗疫病的發(fā)生會使大量錐栗樹減產(chǎn)甚至死亡，結果會造成巨大的經(jīng)濟損失，并帶來嚴重的生態(tài)危害，因此，急需選育出對栗疫病具有較強抗性的新品種來應對栗疫病的危害。為給錐栗高抗病性、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)良種的選育提供參考依據(jù)，以福建省建甌市廣為栽培的17個農(nóng)家品種為供試材料，對其抗栗疫病性與果實表型性狀的變異情況進行了調(diào)查與分析，現(xiàn)將研究結果分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

研究地位于福建省建甌市水源鄉(xiāng)（27°8′5″N，118°48′21″E）。供試品種為福建省建甌市水源鄉(xiāng)廣為栽培的17個錐栗農(nóng)家品種，其分別為‘處暑紅’‘雙峰子’‘大包榛’‘烏榛’‘大尖嘴’‘油榛’‘中尖嘴’‘黃榛’‘鐵錐’‘油桐仔’‘小尖嘴’‘烏殼長芒’‘紅仔榛’‘歐寧仔’‘白露仔’‘牛角仔’（晚熟）和‘牛角仔’（中熟），均為2000年以當?shù)匾吧F栗為砧木嫁接的無性系。采用完全隨機區(qū)組設計，每個試驗小區(qū)各種植10 株，設3 次重復，其株行距均為5 m×6 m。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離與觀察

依據(jù)栗疫病的發(fā)病特征尋找疑似感染栗疫病的植株，采集其侵染部位組織帶回實驗室保存。剪取長×寬為2 mm×2 mm 的病斑組織，用無菌水沖洗干凈后，先將其放入70%的酒精中表面消毒30 s，再放入0.1%的升汞溶液中消毒60 s，然后用無菌水沖洗。將病斑塊接種在PDA 培養(yǎng)基上，置于28 ℃的光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，然后用打孔器在菌落邊緣打取直徑為3 mm 的菌塊，將其接種在新的PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)純化，純化2 次后便可使用。

形態(tài)學的觀察：培養(yǎng)5 d 后觀察菌落的形態(tài)，在光學顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)，測量分生孢子的大小，觀察菌落特征、分生孢子器的顏色和菌絲形態(tài)特征。

病原菌的序列分析：取培養(yǎng)2 ～3 d 的菌落邊緣的菌絲，使用真菌DNA 試劑盒（OMEGA，美國）提取病原菌的DNA。

采用真菌生物通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′）作為擴增引物。

PCR 反應體系：上游引物和下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP 1 μL，rTaq 酶0.5 μL，ddH2O 40.5 μL，將擴增獲得的PCR 產(chǎn)物進行DNA 測序，將獲得的病原菌核糖體DNA-ITS 序列與數(shù)據(jù)庫NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中公布的栗疫菌ITS 區(qū)序列進行同源性比對。

1.2.2 錐栗疫病抗性的檢測

參照有關文獻[18-20]中說明的方法（適當改進）對栗疫病抗性進行評價。從每個農(nóng)家品種中挑選健康植株，選取其1年生枝條進行栗疫菌接種，每株植株各選取粗度一致的枝條6 根，接種前使用無菌水沖洗3 遍，用接種針在枝條表面刺出直徑為3 mm 的環(huán)形傷口，傷口深至木質(zhì)部。用直徑為3 mm 的打孔器將培養(yǎng)5 d 的栗疫菌打成菌塊，每根枝條接種3個菌斑，使用挑針將菌塊的菌絲面與枝條的傷口接壤處貼合，然后用浸水的無菌棉包裹以保濕，最后用保鮮膜將無菌棉包裹起來，防止無菌棉脫落及外來雜菌的侵染，以接種空白培養(yǎng)基的為對照。從所選植株上采集長為20 cm的1年生枝條，帶回實驗室進行室內(nèi)接種。室內(nèi)接種時，將枝條用無菌水沖洗后，先放入2%的次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，再用無菌水沖洗干凈自然風干。同室外接種一樣，每根枝條各接種3個病斑，以接種空白培養(yǎng)基的為對照。室內(nèi)接種時，先將枝條兩端裹上浸了水的無菌棉，然后將其放入接種盤中，再將接種盤用保鮮膜包裹起來置于28 ℃的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。所有的接種材料在接種7 d 后均應取下保鮮膜和無菌棉，再繼續(xù)觀察。

在接種的第21 天，使用游標卡尺對病斑的長和寬進行測量，以橢圓面積的計算公式計算病斑面積。枝條面積=枝條截面周長×病斑長（枝條截面周長=π×病斑處枝條直徑）；染病率=病斑面積/枝條面積。依據(jù)染病率將錐栗疫病侵染程度分為5 級：1 級，染病率＜20%；2 級，20%≤染病率＜30%；3 級，30%≤染病率＜40%；4 級，40%≤染病率＜50%；5 級，染病率≥50%。根據(jù)如下公式計算錐栗疫病染病指數(shù)：染病指數(shù)=∑（代表數(shù)值×病級株數(shù)）×100/（發(fā)病最重級的代表數(shù)值×株數(shù)總和）。再依據(jù)染病指數(shù)將錐栗對疫病的抗性分為如下幾個等級：免疫級（I），染病指數(shù)=0；抗病級（R），0 ＜染病指數(shù)＜35；感病級（S），35 ≤染病指數(shù)＜50；高感病級（H），染病指數(shù)≥50。

1.2.3 果實表型性狀的測定

利用電子天平測量錐栗總苞質(zhì)量和果質(zhì)量，利用游標記卡尺測量果苞長、果苞寬、果苞高、果苞厚、果長、果寬、果高。

果實成分測定主要包括淀粉（蒽酮比色法）[21]、蔗糖（間苯二酚法）[21]、還原性糖（3,5-二硝基水楊酸法）[21]、可溶性糖（蒽酮比色法）[22]、可溶性蛋白（考馬斯亮藍G-250 染色法）[22]。

1.2.4 染病率和果實表型性狀的統(tǒng)計分析

利用Excel 和SPSS 軟件對栗疫病染病率和果實表型性狀分別進行變異分析、方差分析、相關性分析、聚類分析，對栗疫病染病率和果實表型性狀指標測定值進行標準化處理，將室內(nèi)室外接種枝條的栗疫病染病率及其標準化值進行平均化處理，取染病率的負數(shù)值為抗病性數(shù)值，將果實表型性狀指標測定值平均化處理后獲取標準化值，對所有標準化值進行累加并排序，選擇出表現(xiàn)優(yōu)良的農(nóng)家品種。變異系數(shù)、重復力、標準化值的計算公式分別如下：

式（1）～（3）中：CV為變異系數(shù)，S為標準差，M為平均值；R為重復力，F(xiàn)為檢驗值；Zx為標準化值，X為原始值，為總平均值，XS為總平均標準差。

2 結果與分析

2.1 病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌的形態(tài)學觀察

采集疑似栗疫病的病原菌，經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)得到菌株ZLYB。培養(yǎng)3 d 后觀察到的病原菌菌落形態(tài)如圖1所示。從圖1 中可以看出，菌落呈近圓形，菌絲為乳白色，菌落中心為橘黃色，邊緣菌絲為白色。在電子顯微鏡下觀察到的病原菌子實體如圖2所示。從圖2 中可以看出，病原菌的主要特征為：子座大小約0.2 mm，顏色為橘黃色。

圖1 病原菌菌落Fig.1 Colony of pathogenic bacteria

圖2 病原菌子實體Fig.2 Fruiting bodies of pathogens

2.1.2 病原菌核糖體DNA-ITS 序列的比對

將病原菌的序列導入數(shù)據(jù)庫NCBI 中進行比對，獲得其與63 條C.parasitica序列相似度的均值為86.90%；其中，病原菌與C.parasiticaKC844302.1 的相似度最高，為89.76%。依據(jù)病原菌的形態(tài)學觀察結果及病原菌DNA 比對結果，確定分離的病原菌菌株為栗疫菌C.parasitica。

2.2 栗疫病抗性的評價結果

17個錐栗農(nóng)家品種栗疫病抗性的室內(nèi)與室外評價結果見表1。由表1 可知，室內(nèi)接種枝條的栗疫病染病指數(shù)高于室外栗疫菌的接種結果。室外接種枝條上病斑面積最小和最大的農(nóng)家品種分別為‘小尖嘴’與‘雙峰子’，其病斑面積分別為12.8 和76.8 mm2；室內(nèi)接種枝條上病斑面積最小和最大的農(nóng)家品種分別為‘中尖嘴’與‘紅仔榛’，其病斑面積分別為31.7 和95.5 mm2。室外接種枝條染病率最小和最大的農(nóng)家品種分別為‘小尖嘴’與‘烏榛’，其染病率分別為 11.1%和30.3%；室內(nèi)接種枝條染病率最小和最大的農(nóng)家品種分別為‘中尖嘴’與‘紅仔榛’，其染病率分別為22.4%和39.7%。室外接種枝條染病指數(shù)最小和最大的農(nóng)家品種分別為‘小尖嘴’與‘烏榛’，其染病指數(shù)分別為10 和50；室內(nèi)接種枝條染病指數(shù)最小和最大的農(nóng)家品種分別為‘中尖嘴’與‘處暑紅’，其染病指數(shù)分別為33.3 和70.0。17個錐栗農(nóng)家品種栗疫病抗性的綜合評價結果見表2。17個錐栗農(nóng)家品種中，沒有對栗疫病的侵染表現(xiàn)出免疫級(I)抗性的農(nóng)家品種；‘中尖嘴’‘黃榛’‘鐵錐’‘油桐仔’‘小尖嘴’‘牛角仔’（晚熟）‘牛角仔’（中熟）‘白露子’這8個農(nóng)家品種對栗疫病的侵染均表現(xiàn)出R 級（較抗）的抗性；‘大包榛’‘大尖嘴’‘油榛’‘歐寧仔’這4個農(nóng)家品種對栗疫病的侵染均表現(xiàn)出S 級（易感）的抗性；‘處暑紅’‘雙峰子’‘烏榛’‘烏殼長芒’‘紅仔榛’這5個農(nóng)家品種對栗疫病的侵染均表現(xiàn)出H 級（高感）的抗性。

表1 栗疫病抗性評價結果Table 1 Evaluation results of resistance to chestnut blight

表2 栗疫病抗性綜合評價結果Table 2 Comprehensive evaluation results of chestnut blight resistance

2.3 栗疫病抗性和果實表型性狀的變異分析

17個錐栗農(nóng)家品種栗疫病抗性和果實表型性狀的變異分析結果見表3。由表3 可知，17個錐栗農(nóng)家品種的15個表型性狀指標均存在不同程度的變異。果實成分表型性狀中，‘歐寧仔’果實中可溶性糖含量的變異系數(shù)（43.66%）最大；‘油桐仔’果實中還原糖的變異系數(shù)（0.39%）最小。栗疫病表型性狀中，‘黃榛’栗疫病染病率的變異系數(shù)（32.42%）最大，‘小尖嘴’栗疫病染病率的變異系數(shù)（11.17%）最小。果實形態(tài)表型性狀中，‘油榛’果質(zhì)量的變異系數(shù)（42.72%）最大，‘紅仔榛’果苞高的變異系數(shù)（0.63%）最小。

表3 栗疫病抗性和果實表型性狀的變異分析結果Table 3 Variation analysis results of chestnut blight resistance and fruit phenotypic traits

續(xù)表3Continuation of table 3

續(xù)表3Continuation of table 3

2.4 栗疫病抗性和果實表型性狀的方差分析結果及重復力的估算結果

17個錐栗農(nóng)家品種栗疫病抗性和果實表型性狀的方差分析結果見表4。由表4 可知，17個農(nóng)家品種之間除淀粉含量（P=0.275）外的14個表型性狀指標均存在極顯著差異（P≤0.01）；淀粉含量的重復力值（0.208）最小，還原糖含量的重復力值（0.999）最大，平均重復力值為0.883，表明17個農(nóng)家品種表型性狀的穩(wěn)定性均較好，其中果苞厚和淀粉的重復力值均較小，表明這兩個性狀指標受環(huán)境影響較大。

表4 栗疫病抗性和果實表型性狀的方差分析結果?Table 4 Variance analysis results of chestnut blight resistance and fruit phenotypic traits

續(xù)表4Continuation of table 4

2.5 栗疫病抗性和果實表型性狀的相關性分析

17個錐栗農(nóng)家品種栗疫病抗性和果實表型性狀的相關性分析結果見表5。由表5 可知，15個表型性狀間存在一定的相關性，染病率與可溶性糖呈現(xiàn)極顯著負相關，相關系數(shù)為-0.415（P≤0.01）；染病率與蔗糖呈現(xiàn)顯著負相關，相關系數(shù)為-0.292（P≤0.05），染病率與果實其他表型性狀間均無顯著相關性。

表5 15個表型性狀間的相關性分析結果?Table 5 Correlation analysis results of 15 phenotypic traits

2.6 優(yōu)良農(nóng)家品種的選擇

對17個錐栗農(nóng)家品種的栗疫病抗性和9個果實表型性狀指標測定值進行標準化分析，結果見表6。經(jīng)過對所測數(shù)據(jù)的標準化分析，從17個錐栗農(nóng)家品種中篩選得到了‘大包榛’‘白露仔’‘黃榛’這3個抗疫病性較強且果實品質(zhì)優(yōu)良的農(nóng)家品種，其余14個農(nóng)家品種按其抗疫病性的強弱和果實品質(zhì)的優(yōu)劣排序依次為：‘烏榛’‘處暑紅’‘小尖嘴’‘鐵錐’‘油桐仔’‘中尖嘴’‘大尖嘴’‘歐寧仔’‘油榛’‘紅仔榛’‘牛角仔’（中熟）‘烏殼長芒’‘牛角仔’（晚熟）‘雙峰子’。

表6 栗疫病抗性和果實表型性狀指標測定值的標準化值Table 6 Standardized values of measured values of chestnut blight resistance and fruit traits

續(xù)表6Continuation of table 6

2.7 栗疫病抗性和果實表型性狀的聚類分析

17個錐栗農(nóng)家品種栗疫病抗性和果實表型性狀的聚類分析結果如圖3所示。由圖3 可知，‘牛角仔’（中熟）單獨分為1 類；第2 類包括‘牛角仔’（晚熟）‘油桐仔’‘處暑紅’‘紅仔榛’‘烏榛’；第3 類包括‘歐寧仔’‘中尖嘴’‘油榛’‘烏殼長芒’‘雙峰子’‘小尖嘴’‘大尖嘴’‘鐵錐’‘大包榛’‘白露子’‘黃榛’。

圖3 17個錐栗農(nóng)家品種的聚類分析結果Fig.3 Cluster analysis results of 17 C.henryi Cultivars

3 討 論

植物病害抗性評價大多數(shù)都是針對植株活體或者離體枝條、葉片接種病菌進行的，以病斑面積、染病率、染病指數(shù)這3個指標為依據(jù)，能較準確地反映出樣本對病害的抗性。有關小麥[23-24]、玉米[25]、水稻[26]等作物的抗病研究均較透徹。朱玫等[27]研究了36個國家審定小麥品種的抗病性、農(nóng)藝性狀和品質(zhì)，結果發(fā)現(xiàn)，不同品種之間小麥的品質(zhì)和抗病性的差異均較大。溫輝芹等[28]對129個品種小麥的品質(zhì)性狀和抗條銹病進行了分析和評價，結果表明，所有的小麥品種均不是抗銹病的優(yōu)良種質(zhì)。王桂躍等[29]分別研究了76個品種的甜玉米和89個品種的糯玉米的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗病性，結果表明，其產(chǎn)量和品質(zhì)性狀均存在明顯差異，通過綜合分析，篩選獲得了17個抗性較強且果實品質(zhì)較優(yōu)的玉米品種。王金明等[30]對全球66 份水稻育種親本的稻瘟病抗性與稻谷品質(zhì)進行了研究，從中篩選出了11個具有中等抗性、稻米外觀表現(xiàn)優(yōu)良的水稻品種。有關板栗疫病的研究成果較多：徐育海等[18]分別對夏、冬兩個季節(jié)的31個板栗基因型進行離體枝條栗疫菌接種試驗，他們根據(jù)抗性等級的不同，將其分為不同的板栗基因類型，并得出了夏季接種栗疫菌的枝條所表現(xiàn)出的抗性強于冬季接種枝條的結論。程中平等[19]利用3個菌株，分別于5個時期對其離體枝條進行接種試驗，并觀察其染病程度，結果篩選出了5個抗性較強的基因型；秦嶺等[20]利用兩種菌株對21個板栗基因型的疫病抗性進行枝條離體接種試驗，也篩選出了部分抗性較強的基因型，他們研究得出了其對栗疫病的抗性表現(xiàn)較為穩(wěn)定且一致的結論。有關栗屬樹種栗疫病的研究結果為揭示栗疫病菌的侵染機理、挑選抗性基因、開展栗疫病防治等方面的研究奠定了基礎，也為有關錐栗的抗病研究提供了重要的參考依據(jù)。將作物的抗病性與果實品質(zhì)性狀聯(lián)合起來分析進行良種選擇的研究報道已有很多，而將錐栗乃至經(jīng)濟林木的抗病性與果實品質(zhì)聯(lián)合起來分析進行良種選擇的研究報道較少，本研究嘗試結合栗疫病抗性與錐栗果實品質(zhì)進行分析和綜合評價，在選擇抗性個體的同時，也兼顧果實品質(zhì)，最終獲得抗疫病能力較強、品質(zhì)性狀又優(yōu)良的農(nóng)家品種。但是，本研究的局限性在于只用了1年的觀測數(shù)據(jù)。

栗疫病自被發(fā)現(xiàn)之日起，就給栗屬植物帶來了難以逆轉(zhuǎn)的危害。采用常規(guī)防治方法難以徹底遏制栗疫病的傳播與流行，只有選育出抗性強的優(yōu)良品種才能從根本上解決栗疫病的危害問題。目前，雜交育種仍然是抗病選育的主要手段之一。選擇抗性與品質(zhì)差異均較大的錐栗進行有性雜交，可使雙親的基因重新組合，將兩者的優(yōu)良基因集于子代一身，子代甚至可能出現(xiàn)強于親本雙方的超親現(xiàn)象。板栗是公認的抗疫病能力較強的種質(zhì)，開展錐栗與板栗的種間雜交，有望在其子代中選育出抗疫病且果實品質(zhì)優(yōu)良的基因型。傳統(tǒng)的雜交育種周期較長，在基因組測序的基礎上開展分子標記輔助選擇育種，通過常規(guī)育種與分子育種相結合，可提高錐栗育種的效率與精度，最終才可選育出抗性強、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)的品種，以促進錐栗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

4 結 論

對17個錐栗農(nóng)家品種間抗病性和果實表型性狀的相關性進行了分析，結果表明，其抗病性與果實各性狀指標之間存在不同程度的相關性：染病率與果苞刺長呈顯著正相關；染病率與可溶性糖、蔗糖、可溶性蛋白之間均呈負相關，與可溶性糖呈極顯著負相關，而與淀粉、還原糖之間均呈正相關。這一分析結果說明，17個錐栗農(nóng)家品種抗疫病能力越強，其果實中可溶性糖、蔗糖、可溶性蛋白的含量可能越高，而其淀粉和還原糖的含量越低。變異分析結果表明，17個錐栗農(nóng)家品種在抗病性和果實表型性狀上均存在明顯的變異，較大的變異有利于我們從中選擇出符合目標要求的個體。結合抗病性與果實品質(zhì)性狀進行分析與綜合評價及聯(lián)合選擇是可行的，本研究從17個農(nóng)家品種中最終選擇出了‘大包榛’‘白露仔’‘黃榛’這3個抗疫病能力較強、果實品質(zhì)優(yōu)良的農(nóng)家品種。