蔡金秀，夏姍姍，馬佳雯，王佳圓，曹少謙，戚向陽*

（1 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江寧波 315100 2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306）

高血壓是一種常見慢性疾病，影響著31%的成人人口，與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，世衛(wèi)組織（WHO）統(tǒng)計(jì)顯示心血管疾病在全球致死率排名第一[1-2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE） 在調(diào)節(jié)血壓平衡起重要作用，其作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)?？蓪⒀芫o張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，同時(shí)促進(jìn)醛固酮分泌使血壓升高，并能使具有血管舒張的緩激肽失活，導(dǎo)致血管收縮和血壓升高[3]。ACE 抑制劑廣泛應(yīng)用于高血壓的治療，然而常用的抑制劑如卡托普利、賴諾普利、依那普利等藥物[4]具有損害腎功能，引發(fā)高血鉀癥，使血管水腫等副作用，亟需尋找更安全、有效、無副作用的ACE 抑制劑。研究者發(fā)現(xiàn)從天然食品中分離出來的生物活性肽類與ACE 抑制劑有相似的作用，是良好的ACE 抑制劑替代品，這些肽通常在母體蛋白中不起作用，但母體蛋白水解后得到的部分肽段則表現(xiàn)出類激素活性[5-6]。目前已從糧油作物[7-8]、乳制品[9]、海洋生物等[10]中獲得了食源性ACE 抑制肽，雖然這些生物活性肽的功效沒有臨床藥物好，但是其安全、副作用小，易吸收，來源廣泛，且成本較低，因而成為一大研究熱點(diǎn)。

馬面魚為雜食性近底層魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、口感鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，深受人們喜愛，常用來加工成生魚片，最高年產(chǎn)量達(dá)36.0×104t[11]。在加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物通常用來制膠、制革或提取氨基酸等低附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)。副產(chǎn)物中馬面魚皮富含膠原蛋白，由膠原蛋白水解而來的多肽具有降血壓、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種效用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道膠原蛋白是良好的ACE 抑制肽來源，膠原蛋白含有30%以上的疏水氨基酸及豐富的羥脯氨酸，結(jié)構(gòu)中疏水氨基酸能增強(qiáng)其活性，羥脯氨酸可提高其在腸道消化中的穩(wěn)定性[12-14]。有學(xué)者從海洋生物副產(chǎn)物中提取出活性較高的ACE 抑制肽，而未見關(guān)于馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽的研究。本研究以馬面魚皮膠原蛋白為原料制備較高活性ACE 抑制肽，并研究其結(jié)構(gòu)及ACE 抑制活性的穩(wěn)定性，為馬面魚皮的深度開發(fā)及高值化利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬面魚皮收集于寧波路林市場(chǎng)，清洗后瀝干，剪成2 cm×2 cm 小塊，置于-20 ℃保存?zhèn)溆茫荒z原蛋白，由馬面魚皮酸法提取所得；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶，北京Solarbio 公司；蛋白酶P“天野”6G、蛋白酶N“天野”、蛋白酶A“天野”2G、蛋白酶M“天野”G，日本Amano 公司；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸 （N-hippury1-His-Leu tetrahydrate，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），美國Sigma 公司；Sephadex G-15 葡聚糖凝膠，美國GE 公司；乙腈（HPLC 級(jí)），美國Sigma 公司；其它試劑均為國藥分析。

1.2 儀器與設(shè)備

1900PC 型紫外－可見分光光度計(jì)，上海析譜儀器有限公司；UPLC-MS，沃特世（Waters）科技有限公司；高效液相色譜儀，沃特世（Waters）科技有限公司；HH-4 數(shù)顯控溫水浴鍋，上海維誠儀器有限公司；ALPHA2-4 冷凍干燥儀，CHRIST；冷凍離心機(jī)5804R，德國Eppendorf 公司；Labscale 小型切向流超濾，密理博中國有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜法測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的活性 參照朱國萍等[15]的方法略微調(diào)整，樣品處理：往樣品管和空白管加入5 μL ACE 溶液，分別往樣品管和空白管加入10 μL 樣品液和緩沖液，37 ℃溫育5 min 后加入50 μL 6 mmol/L HHL 溶液，于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，加入85 μL 1 mol/L HCL 中止反應(yīng)，用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾后上樣至高效液相色譜進(jìn)行分析，測(cè)定溶液中馬尿酸峰的面積。色譜條件：色譜柱：SunfireTM C18（150×4.6 I.D，5 μm）色譜柱。流動(dòng)相A：乙腈，B：含0.05%（體積分?jǐn)?shù)）TFA 和0.1%（體積分?jǐn)?shù)）三乙胺的超純水；等度洗脫（A/B，25/75，V/V）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長：228 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

式中：A——空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積，mAU·min；B——添加馬面魚皮膠原活性肽組中馬尿酸的峰面積，mAU·min。

1.3.2 水解度的測(cè)定 水解度的測(cè)定參考趙新淮等[16]的方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法如下：將Gly 干燥，配制成20 mg/mL 溶液，再稀釋成含量為2～20 μg/mL 的溶液。各取2 mL 稀釋液（空白管加蒸餾水），加入1 mL 茚三酮顯色劑，混勻，15 min 沸水浴后，冷水中冷卻。每管分別加入5 mL 40%乙醇混勻，放置15 min，以空白管調(diào)零并于570 nm 測(cè)吸光值A(chǔ)。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定步驟測(cè)定酶解液中-NH2含量（mmol/L），用蒸餾水代替酶解液做空白試驗(yàn)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解蛋白液中-NH2含量（mmol/L）。

計(jì)算公式：

式中：h——水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵的物質(zhì)的量，mmol；htot——每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵的物質(zhì)的量，mmol。

1.3.3 不同酶對(duì)膠原蛋白水解的影響 在各酶最適溫度和pH 值下，用木瓜蛋白酶（55 ℃，pH 7）、胰蛋白酶（40 ℃，pH 8）、堿性蛋白酶（40 ℃，pH 10）、菠蘿蛋白酶（55 ℃，pH 7）、中性蛋白酶（40℃，pH 7）、酸性蛋白酶（50 ℃，pH 2.2）、胃蛋白酶（50 ℃，pH 2.2）、蛋白酶P “天野”6G （50 ℃，pH 7）、蛋白酶N“天野”（40 ℃，pH 8）、蛋白酶A“天野”2G（50 ℃，pH 8）、蛋白酶M“天野”G（50 ℃，pH 4.5），在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，加酶量為2 000 U/g條件下，酶解4 h，以ACE 抑制率為主要指標(biāo)，水解度（DH）為參考篩選出最佳用酶。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 以ACE 酶活性抑制率和水解度為指標(biāo)，考察水解時(shí)間（1，2，3，4，5 h），底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%，2%，3%，4%，5%），酶用量（1 200，2 400，3 600 U/g），對(duì)馬面魚皮膠原蛋白酶解的影響。

1.3.5 復(fù)合酶解 根據(jù)單因素結(jié)果選取最佳條件進(jìn)行組合酶解試驗(yàn)，酶解條件如表1。

表1 復(fù)合酶酶解條件Table 1 The hydrolysis conditions of composite enzyme

1.3.6 超濾分離 將酶解液過0.45 μm 濾膜后，依次通過截留分子質(zhì)量為10，8，5 ku 的超濾膜，得到分子質(zhì)量分別為＜5 ku，5～8 ku，8～10 ku，＞10 ku 4 個(gè)級(jí)分，將各級(jí)分冷凍干燥，測(cè)定其ACE 抑制率。

1.3.7 凝膠柱層析分離 用Sephadex G-15（2 cm×50 cm I.D.） 凝膠柱對(duì)超濾所得的抗氧化活性較好的級(jí)分進(jìn)一步分離純化。洗脫為超純水，流速0.3 mL/min，上樣質(zhì)量濃度20 mg/mL，上樣量5 mL，檢測(cè)波長220 nm，收集各洗脫峰，凍干后測(cè)定各組分ACE 抑制率。

1.3.8 高活性馬面魚皮膠原蛋白肽的HPLC 分析 色譜柱：Symmetry C18 柱 （4.6 mm×150 mm I.D.，5 μm）；流動(dòng)相：超純水（A），乙腈（B）；洗脫條件：0～15 min，0%～5%，15～30 min，5%～20%，30～40 min 20%～40%，40～41 min，40%～0%；流 速0.5 mL/min。檢測(cè)波長220 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.9 高活性馬面魚皮膠原蛋白肽的UPLC-MS分析 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 colum （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。洗脫條件：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（A）；乙腈（B）；0～40 min，0～40%，40～42 min，40%～0；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，正離子模式，掃描分子質(zhì)量100～2 000 u，毛細(xì)管電壓3 000 V，錐孔電壓40 V，噴霧35 psi，脫氣溫度350 ℃，離子源溫度120 ℃，N2流速900 L/h。

1.3.10 溫度對(duì)馬面魚皮膠原蛋白肽ACE 抑制率的影響 取一定量的樣品用去離子水配制成2 mg/mL 的溶液，分別在20，40，60，80，100 ℃條件下保溫2 h，快速冷卻至室溫，測(cè)定ACE 抑制率并計(jì)算ACE 抑制活性保持率。

1.3.11 pH 值對(duì)馬面魚皮膠原蛋白肽ACE 抑制率的影響 取一定量的樣品分別用pH 值為2，4，6，8，10 的緩沖液配制成2 mg/mL 的溶液，在40℃條件下保溫2 h，用冷水浸泡使快速恢復(fù)至室溫，測(cè)定其ACE 抑制率并計(jì)算ACE 抑制活性保持率。

1.3.12 體外模擬胃腸道消化對(duì)馬面魚皮膠原蛋白肽ACE 抑制率的影響 參考Zhu 等[17]的方法，體外模擬胃液消化：樣品用pH 2.0 的0.1 mol/L KCl-HCl 緩沖液配制成5 mg/mL 的溶液，按酶與底物質(zhì)量比為1∶100 加入胃蛋白酶，振蕩混勻后在37 ℃下恒溫水浴3 h，沸水浴滅酶5 min，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值到8.0，取一半消化液離心（10 000 r/min，25 min），取上清，測(cè)定ACE 抑制率并計(jì)算ACE 抑制活性保持率。

體外模擬腸液消化：剩余一半消化液按酶與底物質(zhì)量比為1∶100 加入胰蛋白酶，振蕩混勻后在37 ℃下恒溫水浴4 h，滅酶，離心，取上清，測(cè)定ACE 抑制率并計(jì)算ACE 抑制活性保持率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPad Prism 軟件繪圖，SPSS Statistics 軟件進(jìn)行Duncan（D）方差分析，顯著性水平為P<0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對(duì)馬面魚皮膠原蛋白的酶解效果

由圖1可知，馬面魚皮膠原蛋白經(jīng)不同酶水解后，蛋白酶N“天野”2G 酶解產(chǎn)物對(duì)ACE 的抑制率最高胰蛋白酶次之，但由蛋白酶N“天野”2G所制備的酶解產(chǎn)物水解度顯著性低于胰蛋白酶。酶解產(chǎn)物水解度差異較大但ACE 抑制能力相近，可能是由于其氨基酸組成和序列不同，蛋白酶具有專一性其只能作用于特定的位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶解可得到結(jié)構(gòu)組成更豐富的肽鏈，可能能夠提高生物活性肽活性，本研究選擇胰蛋白酶和蛋白酶N“天野”2G 進(jìn)行復(fù)合酶解試驗(yàn)，優(yōu)化制備工藝。

圖1 不同酶對(duì)水解度和ACE 抑制率的影響Fig.1 Effect of different enzyme on the degree of hydrolysis and angiotensin-converting enzyme inhibitory activity

2.2 酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解時(shí)間對(duì)蛋白酶N“Amano”2G 酶解的影響 由圖2可知，用蛋白酶N“天野”2G 水解馬面魚皮膠原蛋白所得產(chǎn)物水解度隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大和時(shí)間的延長而增大后趨于平緩，在加酶量1 200～2 400 U/g 無顯著性差異，3 600 U/g 時(shí)顯著性增大；其對(duì)ACE 抑制率隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)與水解度相近，在4%達(dá)最大值；隨加酶量的增加顯著性下降；由圖2b 可知在水解初期ACE 抑制率無顯著性變化，3 h 時(shí)顯著性增大，4 h 后呈下降趨勢(shì)。綜合水解度和ACE 抑制率考慮，蛋白酶N“天野”2G最佳水解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，加酶量1 200 U/g，酶解時(shí)間4 h。

圖2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解時(shí)間對(duì)蛋白酶N“天野”2G 酶解的影響Fig.2 Effect of substrate concentration，amount and time on Protease N “Amano” 2G enzymatic hydrolysis

2.2.1.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解時(shí)間對(duì)胰蛋白酶酶解的影響 由圖3可知，用胰蛋白酶水解馬面魚皮膠原蛋白所得產(chǎn)物水解度和ACE 抑制率受底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響變化趨勢(shì)一致，在4%時(shí)ACE 抑制活性最強(qiáng)；加酶量增大水解度和ACE 抑制率增大，但當(dāng)大于2 400 U/g 后ACE 抑制率顯著性下降；在水解初期1～3 h 內(nèi)水解度無顯著性差異，后有上升趨勢(shì)，其對(duì)ACE 抑制率隨時(shí)間延長其變化趨勢(shì)較水解度明顯，先上升后下降，在4 h 時(shí)達(dá)最大值。綜上，胰蛋白酶的最佳水解條件為：加酶量2 400 U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，酶解時(shí)間4 h。

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解時(shí)間對(duì)typsin 酶解的影響Fig.3 Effect of substrate concentration，amount and time on typsin enzymatic hydrolysis

通過以上試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加酶量固定時(shí)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加水解度及ACE 抑制率都顯著性上升，但達(dá)到一定濃度后無顯著性變化，可能是由于底物過多，與酶接觸的幾率大大減小，使酶解效果降低[18]。加酶量持續(xù)增大時(shí)水解度顯著提高，但當(dāng)水解度過大時(shí)，ACE 抑制率反而下降，酶解過程是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，酶在不斷的尋找底物中特異的酶切位點(diǎn)，可能是由于前期產(chǎn)生的ACE 抑制肽被水解成低活性的肽段或者氨基酸失去了對(duì)ACE抑制活性[19]。在水解初期底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，酶的作用有限水解度與ACE 抑制率無明顯變化，中期底物與酶充分接觸，更多的肽被釋放出來，水解度與ACE 抑制率顯著性上升，當(dāng)水解進(jìn)行到后期，水解度持續(xù)升高但ACE 抑制率明顯下降，可能是由于此時(shí)原料已被完全反應(yīng)，酶繼續(xù)水解小肽[20]。

2.2.2 復(fù)合酶水解工藝的確定 為了得到高活性ACE 抑制肽，基于單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行了雙酶混合酶解及二步酶解試驗(yàn)。由圖4可知，試驗(yàn)組3 的ACE 抑制率最高，即在蛋白酶N“天野”用量1 200 U/g，胰蛋白酶用量為2 400 U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，溫度40 ℃，pH 8 的條件下，蛋白酶N“天野”和胰蛋白酶混合酶解4 h。

圖4 復(fù)合酶酶解對(duì)酶解度和ACE 抑制率的影響Fig.4 Effect of using mixed enzymes hydrolysis on degree of hydrolysis and angiotensin-converting enzyme inhibitory activity

2.3 馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽的分離純化

2.3.1 超濾分離 由表2可知低分子質(zhì)量肽段ACE 抑制率高于大分子質(zhì)量肽段，a 級(jí)分得率最高，ACE 抑制率也最高，說明有效的ACE 活性成分集中在小于5 ku 分子質(zhì)量物質(zhì)中。Natesh 等[21]的研究表明由2～12 個(gè)氨基酸組成的小分子質(zhì)量肽段比大分子質(zhì)量肽段更容易與ACE 活性位點(diǎn)結(jié)合，表現(xiàn)出更強(qiáng)的ACE 抑制活性。

表2 超濾分離組分及其抗氧化活性Table 2 Ultrafiltration separation components and their antioxidant activity

2.3.2 凝膠柱層析分離 用Sephadex G-15 葡聚糖凝膠柱將超濾所得級(jí)分中抗氧化活性較強(qiáng)的a級(jí)分進(jìn)一步分離，其洗脫曲線如圖5a 所示。經(jīng)凝膠過濾分離后，得到a1、a2、a33 個(gè)級(jí)分，a1出峰最早說明其分子質(zhì)量較大，a3出峰最晚說明分子質(zhì)量較小。由圖5b 可知，分離所得各組分表現(xiàn)出不同的ACE 抑制活性，a1、a2、a3對(duì)ACE 的抑制率均顯著高于分離前，分別為46.52%，43.9%，43.33%，3 個(gè)級(jí)分ACE 抑制率無顯著性差異（P＞0.05）。

圖5 凝膠過濾分離色譜及各組分抗氧化活性Fig.5 Chromatogram of gel filtration column and the antioxidant activity of each component

2.4 馬面魚皮ACE 抑制肽活性穩(wěn)定性研究

2.4.1 pH 值對(duì)馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 由圖6可知，a1、a2、a3在不同pH 值下的ACE 抑制活性保持率趨勢(shì)基本一致，在pH 2～8 時(shí)ACE 抑制活性略有下降，但保留了90%左右的活性。pH 值增大至10 時(shí)，其ACE 抑制活性保持率顯著性降低為原來的80%左右，可能是強(qiáng)堿條件下，肽易發(fā)生消旋反應(yīng)，使肽鏈結(jié)構(gòu)改變從而活性降低[20]?？傮w來看a1、a2比a3較為穩(wěn)定，在酸性和堿性條件下能保持較高活性。

圖6 pH 值對(duì)ACE 抑制肽a1、a2、a3 活性穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of pH on the ACE inhibitory activity stability of a1，a2，a3

2.4.2 溫度對(duì)馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 如圖7所示，溫度的升高對(duì)馬面魚皮膠原ACE 抑制肽活性有一定程度的影響，膠原蛋白活性肽a1、a2、a3的ACE 抑制活性隨溫度升高逐漸降低，但其活性均保留有90%以上，a1活性保持率始終較a2、a2高。楊鋒等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)醋蛋多肽ACE 抑制活性對(duì)熱不穩(wěn)定，在100 ℃時(shí)活性僅保持了60%左右。也有研究表明ACE 抑制肽在高溫下活性升高，可能是高溫使肽鏈分解生成新的肽段與之產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而提高ACE 抑制活性[23]；而陳秋鑾等[18]制備的牡丹籽ACE 抑制肽活性幾乎不受溫度的影響，有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。多肽活性的改變可能與高溫改變肽鏈C 端序列有關(guān)，C 端序列是影響ACE 結(jié)合的重要因素[24]。相對(duì)而言，馬面魚皮膠原ACE 抑制肽熱穩(wěn)定性較高，能夠在加工熱處理中保持較高的活性，是一種良好的ACE 抑制劑。

圖7 溫度對(duì)ACE 抑制肽a1、a2、a3 活性穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperature on the ACE inhibitory activity stability of a1，a2，a3

2.4.3 體外模擬胃腸消化對(duì)馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響 由圖10可知，馬面魚皮膠原ACE 抑制肽經(jīng)胃消化道模擬消化后活性均有下降，a1、a2較a3穩(wěn)定活性均保留為原來的90%左右，而a3經(jīng)胃模擬消化后僅保留有82.26%的活性。經(jīng)腸模擬消化后a1、a2、a3ACE 抑制活性保留率分別為79.76%，73.32%，71.43%，由此可見a1較為穩(wěn)定。消化后ACE 抑制活性降低，可能是由于消化過程中胰蛋白酶和胃蛋白酶繼續(xù)對(duì)肽鏈水解，生成低活性或無活性的肽段或氨基酸。a1較a2、a3穩(wěn)定可能是因?yàn)槠湮傅鞍酌负鸵鹊鞍酌该盖形稽c(diǎn)少，或者是因其分子質(zhì)量較大經(jīng)水解后生成了具有ACE 抑制活性的短肽。

圖8 體外模擬胃腸消化對(duì)ACE 抑制肽a1、a2、a3活性穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of gastrointestinal digestion on the ACE inhibitory activity stability of a1，a2，a3

圖10 馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽主成分質(zhì)譜圖Fig.10 MS spectra of major ingredient of ACE inhibitory peptides

2.5 馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽的分析

綜合pH 值、溫度、體外模擬胃腸道消化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，a1穩(wěn)定性及活性均較好，其HPLC 及UPLCMS 分析表明（見圖9），級(jí)分a1純度較高，分析其不同的碎片離子片段，發(fā)現(xiàn)m/z 為329.2 的離子信號(hào)最強(qiáng)，其中m/z 為272.2 的碎片離子由m/z 為329.2 的碎片離子裂解形成，而m/z 為173.1 的碎片離子是由m/z 為272.2 的碎片裂解產(chǎn)生的。329.2的離子碎片與272.2 的離子碎片的m/z 差值為57，由此可推斷多肽末端有一個(gè)甘氨酸，而272.2的離子碎片與173.1 的碎片的m/z 差值為99.1，可推斷出為一個(gè)纈氨酸，而m/z 為173.1 正好是一個(gè)丙氨酸分子質(zhì)量，因此可推斷出此物質(zhì)可能為一個(gè)三肽，其結(jié)構(gòu)可能為Gly-Val-Ala 或Ala-Val-Gly。大量研究表明活性肽的C 末端為疏水性氨基酸可增強(qiáng)ACE 抑制活性，Yu 等[25]對(duì)21 中大西洋鮭魚活性肽進(jìn)行構(gòu)效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肽鏈中疏水氨基酸與芳香族氨基酸的含量與ACE 抑制活性呈正相關(guān)。Jocksan 等[26-27]認(rèn)為當(dāng)C 端倒數(shù)第2 個(gè)氨基酸為脂肪族氨基酸（Val、Ala、Pro 等）時(shí)ACE 活性較強(qiáng)。所制備的ACE 抑制肽中Ala 和Val 為疏水氨基酸，Val 位于C 末端倒數(shù)第2 位，綜上所述馬面魚皮膠原蛋白ACE 抑制肽結(jié)構(gòu)基本符合目前研究報(bào)道的構(gòu)效學(xué)特征，從而呈現(xiàn)出較高的ACE 抑制活性。

圖9 高效液相分離色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram

3 結(jié)論

以馬面魚皮為原料，在制備膠原蛋白的基礎(chǔ)上，通過酶解法制備有ACE 抑制活性的生物活性多肽。結(jié)果表明，利用雙酶混合法可制備出活性較高的ACE 抑制肽，當(dāng)?shù)鞍酌窷“天野”2G 用量1 200 U/g，胰蛋白酶用量2 400 U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%在溫度40 ℃，pH 8 的條件下混合酶解4 h時(shí)所制備的酶解產(chǎn)物ACE 抑制率最高。酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離后，得到的4 個(gè)級(jí)分中，分子質(zhì)量小于5 ku 的級(jí)分得率最高，其ACE 抑制率也最高，說明ACE 抑制活性物質(zhì)分子質(zhì)量分布主要在5 ku以下。對(duì)a 級(jí)分進(jìn)行凝膠過濾分離得到3 個(gè)級(jí)分（a1、a2、a3），它們對(duì)ACE 抑制率比分離前提高了兩倍左右，其中a1級(jí)分的ACE 抑制率最高，為46.52%?？疾觳煌琾H 值、溫度及體外模擬胃腸消化對(duì)a1、a2、a3活性的影響，發(fā)現(xiàn)所制備的ACE 抑制肽在酸性和弱堿性條件下較為穩(wěn)定，隨溫度的升高活性略有下降，但仍能保留90%左右的活性，說明溫度對(duì)其活性影響不大；經(jīng)體外模擬胃液消化后，其活性降低了10%左右，模擬腸液消化后活性繼續(xù)下降，其中a3下降最為明顯，僅保持了71.4%的活性，而級(jí)分a1最為穩(wěn)定，HPLC 及UPLC-MS 分析表明，所制備的a1純度較高，其氨基酸序列可能為Gly-Val-Gla 或Gla-Val-Gly。