王 濤，翟 晨，欒鑫鑫，王書雅，謝云峰，王 亮*

（1 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 烏魯木齊 830017 2 中糧營養(yǎng)健康研究院 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 102209 3 北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部 北京 100124）

番茄是世界產(chǎn)量最豐富的常見蔬菜之一，其內(nèi)富含番茄紅素、維生素C 和過氧化氫酶，營養(yǎng)價(jià)值極高[1-2]，然而易產(chǎn)生劣變。過氧化氫酶是一種典型的抗氧化酶，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，用于代謝乙醇。過氧化氫酶將過氧化氫分解后，產(chǎn)生無毒、無害的水和氧氣，可以保護(hù)細(xì)胞免受來自內(nèi)源性代謝的過量活性氧（ROS）或外部微環(huán)境，減緩果蔬腐敗變質(zhì)[3-5]。

在所有可能的溶劑中，水無疑具有出色的安全性，這是因?yàn)樗疅o毒、不易燃，價(jià)格便宜且資源豐富。除具有安全和環(huán)保優(yōu)勢外，水還表現(xiàn)出優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì)。其獨(dú)特而牢固的氫鍵網(wǎng)絡(luò)可以直接影響反應(yīng)機(jī)理，加速或降低反應(yīng)速率。離子液體通常由陽離子（有機(jī)）和陰離子（無機(jī)或有機(jī)）組成，組成離子熔點(diǎn)較低（<100 ℃）。其中，陽離子通常由咪唑、季銨鹽或磷離子組成，常見的陰離子部分包括氯離子、溴離子、四氟化硼、六氟化磷、雙（三氟磺酰）亞胺等。其具有較高的熱穩(wěn)定性，相對(duì)較高的黏度，較大的電化學(xué)窗口，非常低的揮發(fā)性等特性，這些特性吸引研究人員在合成和萃取時(shí)應(yīng)用[6-8]。離子液體對(duì)與之混溶液體的極性接受度高，支持有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)的同步溶解，因而被成功用于從溶液中提取物質(zhì)的研究。通過選擇合適的、烷基鏈長度不同的陽離子和陰離子，可以調(diào)節(jié)離子液體的物理性質(zhì)[9-15]。離子液體在有機(jī)合成、催化、液-液萃取、電化學(xué)、形態(tài)研究、核后處理等方面的應(yīng)用近年來得到廣泛的研究[16-19]。水和離子液體可以相互受益，形成一種新的介質(zhì)，從而發(fā)揮兩種成分的優(yōu)點(diǎn)。借助弱范德瓦爾斯力、庫侖力，強(qiáng)共價(jià)鍵等，以化學(xué)成鍵吸附或物理吸附等形式，增大離子液體與納米材料之間的接觸面積，從而提高離子液體的催化、分離性能，同時(shí)磁性納米粒子的引入可以有效避免離子液體的損失[20-23]。不僅拓寬彼此適用范圍，還能降低成本。

Zhu 等[24]采用咪唑鎓離子液體-水混合物從小球藻中提取葉黃素，提取率高達(dá)98.06%。Mishra等[25]研究用極少量離子液體三辛基硫代水楊酸銨在不同體積、pH 值和鈾濃度的水介質(zhì)中提取鈾的效率，結(jié)果表明對(duì)于雜質(zhì)含量較低的樣品，離子液體提取鈾的效率高達(dá)85%。Geng 等[26]利用N-烷基碳酸咪唑離子液體分離萃取高酸油中的環(huán)烷酸，其再生及回收率高達(dá)92%，離子液體也可回收利用。Li 等[27]采用六烷基胍離子液體液-液萃取茶樹油中的4-萜烯醇，單次提取率可達(dá)90%。Deng等[28]以疏水離子液體為萃取劑，在最佳提取條件下，對(duì)生物油水餾分中乙酸、苯酚、愈創(chuàng)木酚和4-甲基愈創(chuàng)木酚的提取率分別為2.71%，95.41%，92.04%和97.98%，表明此種離子液體對(duì)生物油水餾分中的酚類物質(zhì)具有較好的選擇性和提取效率。上述研究表明利用離子液體的萃取是可行的。

本研究選用1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體，萃取番茄細(xì)胞中的過氧化氫酶。通過測定萃取酶活性，考察1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量、萃取時(shí)間和溫度等參數(shù)對(duì)酶活的影響，確定提取過氧化氫酶的最優(yōu)參數(shù)并與緩沖溶液萃取法作比較，旨在為實(shí)現(xiàn)高活性過氧化氫酶等蛋白類物質(zhì)的高效萃取拓展思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

由上海士鋒生物科技有限公司生產(chǎn)的過氧化氫酶2 000 U/mg，由海默尼化工科技有限公司生產(chǎn)的1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Reference 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；11-102-49SH 渦旋混勻器，德國IKA公司；U-3900 紫外可見分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；THZ-103B 恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PB-10 pH 計(jì)，德國Sartorius 公司；Thermo ST16R 離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Multi-mode Synergy Mx 酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 1 -羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體萃取酶蛋白 準(zhǔn)確稱取175 mg 納米磁流體加入離心管中，加入1.5 mL 水溶解，形成雙水相體系，再加入預(yù)制番茄泥0.1 g，充分振蕩后置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中，于200 r/min 轉(zhuǎn)速下振蕩20 min，靜置直至兩相分離，提取上層清液中的過氧化氫酶，測定活性指標(biāo)。圖1為磁性固相體系萃取酶的原理圖。

圖1 磁性固相體系萃取酶原理圖Fig.1 Schematic diagram of extractase in magnetic solid phase system

1.3.2 緩沖溶液法萃取分離酶蛋白 量取4.5 mL pH=7.8 的PBS 緩沖液置于離心管，再加入0.1 g 番茄泥漿，充分混合后于5 000 r/min 轉(zhuǎn)速下保持40 min，靜置后提取上層清液待用，離心和靜置保存均于4 ℃恒溫下完成。

1.3.3 提取工藝優(yōu)化 測定不同離子液體添加量 （150，175，200，225，250 mg）、萃取溫度（20，25，30，35，40 ℃） 及離心時(shí)間（20，25，30，35，40 min）條件下，提取酶活性的變化。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以提取酶活性作為響應(yīng)值，針對(duì)3 個(gè)變量設(shè)計(jì)單因素響應(yīng)面試驗(yàn)，每個(gè)變量因素設(shè)定3 個(gè)水平，各因素具體設(shè)定值如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Response surface experimental design

1.3.5 酶蛋白活性測定 采用紫外分光光度法測定酶活[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 1 -羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體用量 由圖2a 可知，隨離子液體加入量的提高酶活逐漸升高，當(dāng)加入量達(dá)到175 mg 時(shí)，萃取效果最好，之后隨著離子液體加入量升高，酶活性逐漸降低，因此離子液體加入量應(yīng)控制在175 mg。

2.1.2 萃取溫度 如圖2b 所示，當(dāng)其它試驗(yàn)條件固定的前提下，于35 ℃提取的酶活性最理想，即該溫度為試驗(yàn)最佳萃取溫度參數(shù)。

2.1.3 萃取時(shí)間 如圖2c 所示。隨萃取時(shí)間增加，過氧化氫酶活性逐漸增加，30 min 時(shí)酶活性最高。因此，最優(yōu)萃取時(shí)間為30 min。

圖2 單因素酶活試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Single factor enzyme activity test results

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次回歸擬合方程Y=347.64+0.27A+1.78B-0.031C+2.94AB+1.25AC+8.34BC-28.01A2-26.91B2-30.26C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 2 Response surface experiment design scheme

模型方程方差小于0.0001，為差異極顯著因素；失擬項(xiàng)P 值為0.5090（＞0.05），表明該因素差異不顯著，即回歸方程擬合結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果相吻合。因此，該模型用于酶活分析獲取的結(jié)果真實(shí)可靠。在A、B、C 3 個(gè)因素中，B 對(duì)酶活影響最大，A次之，C 相對(duì)最小，即萃取溫度最顯著，1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量次之，萃取時(shí)間影響相對(duì)較小。

2.2.2 響應(yīng)面分析 繪制如圖3所示的響應(yīng)曲面圖，用于分析對(duì)比A、B、C 因素兩兩組合對(duì)酶活影響的強(qiáng)弱。

表3 方差分析表Table 3 Anova table

圖3 三因素間兩兩交互的響應(yīng)面及等高線圖Fig.3 The response surface and contour map of the interaction among various factors

由上圖三維響應(yīng)面趨勢可知，三因素的兩兩交互作用對(duì)酶活影響顯著，由等高線圖可確定最高酶活對(duì)應(yīng)的三因素水平范圍，分析結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果相一致，證明響應(yīng)面模型和等高線模型的可靠性，并由此確定最佳過氧化氫酶萃取試驗(yàn)條件：1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量175.99 mg、萃取溫度及時(shí)間分別為34.87 ℃、30.14 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為兼顧試驗(yàn)操作可行性，將各因素設(shè)定為1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量176 mg、萃取溫度及時(shí)間分別設(shè)定為35 ℃、30 min。由酶活測量的3 次平行試驗(yàn)結(jié)果可知，酶活平均值（345.68 U/g）與預(yù)測值（345.15 U/g）相近，進(jìn)而再次證明所建立模型的可靠性。

2.4 磁性固相體系與PBS 緩沖溶液萃取番茄中5 種蛋白酶的比較

表4為在最優(yōu)條件下對(duì)番茄中5 種抗氧化酶進(jìn)行萃取的結(jié)果，由表可以看出，通過磁性固相提取的各種酶的活性均明顯高于PBS 緩沖溶液法，且大部分標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是納米材料與離子液體對(duì)蛋白酶的強(qiáng)有力的吸附萃取效果，實(shí)現(xiàn)高活性蛋白酶類物質(zhì)的高效提取?？偠灾?，與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比，由磁性固相體系萃取法抵御外界干擾的效果更優(yōu)，提取的蛋白酶活性更穩(wěn)定。

表4 磁性固相體系與PBS 緩沖溶液萃取番茄中5 種蛋白酶的比較Table 4 Comparison of five proteases extracted from tomato with magnetic solid phase system and PBS buffer solution

3 結(jié)論

本研究基于新型離子液體1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體，以番茄細(xì)胞過氧化氫酶提取為例，優(yōu)化了蛋白酶類物質(zhì)萃取試驗(yàn)條件。以酶活為指標(biāo)對(duì)1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體的加入量、萃取溫度及時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，并對(duì)以上3 個(gè)顯著變量分別設(shè)計(jì)單因素響應(yīng)面試驗(yàn)，并與試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。模型、試驗(yàn)兩方面的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：1-羥乙基-3-甲基咪唑基Fe3O4納米磁流體加入量176 mg、萃取溫度及時(shí)間分別設(shè)定為35 ℃、30 min 時(shí)，提取酶的活性最高。本試驗(yàn)以番茄細(xì)胞過氧化氫酶提取為基礎(chǔ)，優(yōu)化了傳統(tǒng)的蛋白酶類物質(zhì)萃取方法，將萃取周期由原來的40 min 縮短至30 min，在保證酶活的同時(shí)提高了萃取效率。