周學(xué)府，鄭遠(yuǎn)榮，鐘 宇，王丹鳳，鄧 云

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海201100 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心 光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院 上海 200436）

酪蛋白（Casein）是牛乳中關(guān)鍵蛋白質(zhì)之一，主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成。在牛乳中大多數(shù)酪蛋白呈膠束球形顆粒，約10%～20%以溶解或非膠束的形式存在[1]。作為一種全蛋白，酪蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并具有良好的功能特性，因而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[2]。

高密度二氧化碳（DPCD）是一種新型的非熱加工技術(shù)，它通過在溫度低于60 ℃，壓強(qiáng)低于50 MPa 的條件下，利用CO2的分子效應(yīng)實(shí)現(xiàn)殺菌和鈍酶的目的，最大限度地保持食品感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，延長(zhǎng)其保質(zhì)期[3]。DPCD 與傳統(tǒng)熱處理相比，具有能耗低，對(duì)食品品質(zhì)影響較小等優(yōu)勢(shì)，被公認(rèn)為食品工業(yè)具有發(fā)展前景的冷殺菌技術(shù)[4]。

據(jù)報(bào)道，DPCD 能夠在殺滅微生物的同時(shí)，影響食品中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及物理特性[4-5]，從而引起食品品質(zhì)變化。研究表明[3，6]，DPCD 能使蝦肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊，并破壞肌球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，與此同時(shí)也改變其溶解度、濁度、黏度等物理特性。目前關(guān)于DPCD 對(duì)乳制品特征蛋白結(jié)構(gòu)、功能和品質(zhì)的影響鮮有研究報(bào)道。本試驗(yàn)研究DPCD 處理前、后酪蛋白結(jié)構(gòu)和物理特性的變化，探究其隨壓強(qiáng)、時(shí)間、溫度改變的規(guī)律，為乳制品的加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 酪蛋白酸鈉（Casein Sodium，酪蛋白含量≥90%），Adamas 公司；Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要儀器 間歇式高密度二氧化碳裝置（HKY-1），海安石油科研儀器有限公司；圓二色譜儀（J-815 spectrometer），日本分光公司；多功能酶標(biāo)儀（M1000），瑞士帝肯公司；納米粒度分析儀（Zetasizer Nano S），英國(guó)Malvern 公司；流變儀（Haake RS 6000），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；均質(zhì)機(jī)（PT 10-35 GT），瑞士Kinematica 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酪蛋白酸鈉溶液制備 稱取0.5 g 酪蛋白酸鈉溶解于50 mL 去離子水，室溫下于磁力攪拌器上攪拌20 min，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的酪蛋白酸鈉溶液。

1.2.2 間歇式DPCD 處理 首先打開循環(huán)水泵和冷箱，使處理釜溫度升至設(shè)定值并使冷箱溫度降至4 ℃左右。將50 mL 蛋白溶液平均分裝于3 個(gè)離心管，并放置于DPCD 處理釜中。密封后打開真空泵抽取處理釜中多余氣體，打開CO2總閥、進(jìn)氣閥以及加壓泵，待處理釜中壓強(qiáng)升至設(shè)定值后關(guān)閉閥門和加壓泵（升壓過程約持續(xù)7 min），樣品在恒定溫度和壓強(qiáng)下保持一段時(shí)間。處理結(jié)束后打開放氣閥緩慢泄壓（泄壓過程約持續(xù)3 min）。本研究針對(duì)壓強(qiáng)、溫度、時(shí)間3 種因素進(jìn)行單因素重復(fù)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案如下：

1）固定溫度35 ℃，時(shí)間25 min，設(shè)置壓力梯度為5，10，15，20，25，30 MPa；

2）固定溫度35 ℃，壓強(qiáng)15 MPa，設(shè)置時(shí)間梯度為5，15，25，35，45 min；

3）固定壓強(qiáng)15 MPa，時(shí)間25 min，設(shè)置溫度梯度為35，34，55，65 ℃，并以相同溫度的單純熱處理作為對(duì)照。

1.2.3 圓二色譜分析 酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)通過圓二色譜儀進(jìn)行測(cè)定[7]。將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）稀釋至0.1 mg/mL。在25 ℃條件下，使用光程長(zhǎng)度為1 mm 的石英比色皿在190～260 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)以100 nm/min 的速率掃描，每次掃描進(jìn)行3 次重復(fù)。使用相同濃度磷酸鹽緩沖液對(duì)所有測(cè)得的光譜進(jìn)行基線校正。

1.2.4 表面疏水性（H0） 使用1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（ANS）測(cè)定酪蛋白的表面疏水性[8]，將每組蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）稀釋至5 個(gè)不同的質(zhì)量濃度（0.05～0.2 mg/mL），將10 μL ANS（8 mmol/L）添加至4 mL 樣品溶液中，靜置3 min。用熒光光譜儀在390 nm（激發(fā)波長(zhǎng)）和470 nm（發(fā)射波長(zhǎng)）下進(jìn)行測(cè)定。熒光強(qiáng)度隨蛋白濃度變化的斜率即為相對(duì)表面疏水性，進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.5 溶解性 將酪蛋白樣品于25 ℃、8 000 r/min 離心15 min，取上清液，通過Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液可溶性蛋白含量。溶解度按以下公式計(jì)算：

1.2.6 動(dòng)態(tài)光散射（DLS） 通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定蛋白樣品的粒徑，方法如下[10]：將蛋白樣品用去離子水稀釋至1 mg/mL，用納米激光粒度儀測(cè)定酪蛋白的粒徑，每組樣品測(cè)定3 次取其平均值。

1.2.7 表觀黏度 酪蛋白溶液的流變學(xué)特性通過流變儀評(píng)估[11]。通過流變儀測(cè)定酪蛋白溶液（10 mg/L） 表觀黏度與剪切速率的函數(shù)關(guān)系，試驗(yàn)條件：平板間距：1 mm，溫度：25 ℃，剪切速率范圍：0.1～100 s-1。

1.2.8 乳化性 將6 mL 酪蛋白溶液 （10 mg/mL）和2 mL 玉米油混合，使用均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min轉(zhuǎn)速均質(zhì)1 min，從離心管底部吸取20 μL 新鮮配置的乳液，加入至5 mL 0.01 g/L SDS 溶液中，混合均勻，在500 nm 處測(cè)量吸光度，記為A0。乳液靜置30 min 后，以相同的方法吸取乳液稀釋于SDS溶液中，在500 nm 處測(cè)量吸光度，記為A30，以0.01 g/L SDS 溶液作為對(duì)照，試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。酪蛋白的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）計(jì)算公式如下：

式中：T=2.303；N——稀釋倍數(shù)；C——乳狀液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL；Φ——乳狀液中油相的體積分?jǐn)?shù)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析。使用單因素方差分析（ANOVA）分析數(shù)據(jù)，并進(jìn)行Duncan的多范圍檢驗(yàn)以確定平均值之間的差異。結(jié)果在P<0.05 時(shí)被認(rèn)為有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)

DPCD 對(duì)酪蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響如圖1和表1所示。從圖1看出，酪蛋白CD 光譜在波長(zhǎng)為200 nm 附近均出現(xiàn)1 個(gè)明顯的負(fù)峰，表明酪蛋白含有大量的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[12]，Kong 等[12]也發(fā)現(xiàn)類似的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)DPCD 處理后酪蛋白的CD 光譜信號(hào)強(qiáng)度顯著降低，意味著處理對(duì)酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。表1顯示了DPCD 處理前后酪蛋白的4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，能看出酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)呈無規(guī)則卷曲，這與CD 光譜特征峰分析結(jié)果一致。DPCD 能夠顯著降低酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量（P<0.05），尤其在高壓（30 MPa）和長(zhǎng)時(shí)間（45 min）處理?xiàng)l件下其影響更為顯著，其α-螺旋含量從8.15%分別降低至5.65%和5.95%。α-螺旋含量減少，表明維持酪蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵部分?jǐn)嗔?，使得蛋白質(zhì)處于伸展?fàn)顟B(tài)。但在溫度較高處理?xiàng)l件下（55 ℃、65 ℃），酪蛋白α-螺旋含量分別上升至10.1%和8.6%，可能是因?yàn)楦邷睾虳PCD 的協(xié)同作用增強(qiáng)了酪蛋白分子相互作用，改變蛋白質(zhì)氫鍵取向從而生成更多氫鍵。另外，35 ℃下DPCD 使酪蛋白中的β-折疊含量顯著增大（P<0.05），無規(guī)則卷曲含量降低，說明其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲存在向β-折疊轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。DPCD 導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生此類轉(zhuǎn)變?cè)谄渌鞍踪|(zhì)中也有所報(bào)道，例如蝦肌球蛋白[6]和肌紅蛋白[13]。

表1 DPCD 對(duì)酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分含量影響Table 1 The effect of DPCD treatment on second structure fractions of casein

（續(xù)表1）

2.2 表面疏水性（H0）

DPCD 對(duì)酪蛋白表面疏水性影響如圖2所示。隨著DPCD 處理壓強(qiáng)增大以及溫度升高，酪蛋白表面疏水性先升高后下降，分別在處理壓強(qiáng)為20 MPa，溫度為45 ℃條件下達(dá)到最大值（18.49 和22.16）。而在一定范圍內(nèi)，處理時(shí)間越長(zhǎng)其表面疏水性越大。

圖2 DPCD 對(duì)酪蛋白表面疏水性影響Fig.2 The effect of DPCD on the surface hydrophobicity of casein

總體而言，DPCD 能夠顯著增大酪蛋白的表面疏水性（P<0.05），暴露出埋藏于分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)，其歸因于超臨界CO2作為疏水性溶劑，能通過與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中疏水性基團(tuán)反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性起修飾作用[14]。Ding 等[14]和Sheng等[15]的研究也存在相似結(jié)果，其研究表明，經(jīng)DPCD 處理后的蛋清和全蛋液的表面疏水性顯著上升。而在本研究中，高壓（25，30 MPa）以及高溫（55，65 ℃） 導(dǎo)致酪蛋白表面疏水性降低是因?yàn)楦邏汉透邷乜蓪?dǎo)致疏水性基團(tuán)相互結(jié)合而重新掩埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部[6]。

2.3 物理特性

2.3.1 溶解度 DPCD 對(duì)酪蛋白溶解度影響如表2所示。與未處理的酪蛋白相比，經(jīng)DPCD 處理后酪蛋白溶解度顯著降低 （P<0.05）。其原因是CO2降低了體系pH 值及其對(duì)酪蛋白堿性氨基酸的修飾作用[16-17]。

由表2可知，隨著處理壓強(qiáng)增大以及處理時(shí)間延長(zhǎng)，酪蛋白溶解度呈降低趨勢(shì)，其歸因于升壓能增大CO2在水中的密度與溶解度以及長(zhǎng)時(shí)間處理使CO2得以充分溶解與擴(kuò)散，從而增強(qiáng)CO2分子效應(yīng)。對(duì)于溫度影響而言，單純熱處理未能影響酪蛋白溶解度，而高溫條件（55，65 ℃）下DPCD 使其溶解度急劇下降，從93.98%分別降至38.62%和42.68%，這與酪蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的異常變化相關(guān)。溶解度作為酪蛋白重要的物理性質(zhì)之一，與其它功能性質(zhì)如乳化性、起泡性存在緊密聯(lián)系[18]。因此考慮到DPCD 對(duì)酪蛋白溶解度影響，在相同殺菌效果前提下，選擇較低的DPCD 處理壓強(qiáng)、溫度和較短處理時(shí)間對(duì)乳制品進(jìn)行殺菌能減少酪蛋白的沉淀。

2.3.2 粒徑 表2顯示了DPCD 處理前后的平均粒徑，可用于分析酪蛋白的分子鏈構(gòu)象、聚集體尺寸及形態(tài)。由表2可知酪蛋白粒徑隨DPCD 處理壓強(qiáng)升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)先減小后增大；溫度方面，升高處理溫度能夠引起酪蛋白粒徑突增，尤其在55 ℃處理溫度下，其粒徑突變至1 030.43 nm。

表2 DPCD 對(duì)酪蛋白物理性質(zhì)的影響Table 2 The effect of DPCD treatment on physical properties of casein

以上結(jié)果表明，DPCD 對(duì)酪蛋白粒徑的影響是處于使其解離和聚集的動(dòng)態(tài)平衡中[19]，在高壓（30 MPa）、長(zhǎng)時(shí)間（45 min）以及較高溫（45，55，65℃） 的處理?xiàng)l件下，DPCD 對(duì)酪蛋白聚集效應(yīng)大于解離效應(yīng)而引起其粒徑增大，而其它條件下DPCD 對(duì)酪蛋白存在輕微解離效應(yīng)。蛋白質(zhì)的解離可能是因?yàn)镈PCD 處理過程中，溶液中不僅存在酪蛋白間的相互作用，同時(shí)也存在CO2與蛋白質(zhì)的相互作用，如疏水相互作用、氫鍵、靜電作用[20]等，從而導(dǎo)致蛋白間的相互作用減弱而解離[19]。高溫（55，65 ℃）下DPCD 誘導(dǎo)酪蛋白粒徑的突變與二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性變化相符，再次印證高溫和DPCD 存在一定協(xié)同作用，共同引起酪蛋白聚集沉淀。蛋白質(zhì)粒徑可影響其吸收率和食品感官品質(zhì)[21]，蛋白較小粒徑賦予食品細(xì)膩的口感和更高的消化吸收率。因此，DPCD 對(duì)乳制品殺菌過程中應(yīng)避免較高的處理溫度以及處理壓強(qiáng)。

2.3.3 表觀黏度 DPCD 處理前后的酪蛋白溶液的流動(dòng)行為如圖3所示。酪蛋白在剪切速率（0.01～1 s-1） 范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的假塑性行為，而在（1～100 s-1）范圍內(nèi)其表觀黏度變化不顯著，近似于牛頓流體。雖然DPCD 對(duì)酪蛋白結(jié)構(gòu)具有破壞作用，但仍未改變其剪切稀化的流動(dòng)行為。由圖3可知，DPCD 顯著降低酪蛋白的表觀黏度，其原因一方面來自于較小的粒徑導(dǎo)致酪蛋白體系流動(dòng)性增強(qiáng)[22]。另一方面，蛋白質(zhì)黏度與其溶解度存在一定關(guān)系[23]，只有同時(shí)具備高溶解度以及強(qiáng)吸水性才能產(chǎn)生高黏度體系。因此受DPCD 影響，酪蛋白溶解度降低使得酪蛋白與水的體系表觀黏度下降，這也能解釋高溫處理?xiàng)l件下酪蛋白粒徑增大但表觀黏度降低的現(xiàn)象。范金波等[24]與Sheng 等[15]有相似的研究結(jié)果，全蛋液和蛋清液經(jīng)DPCD 處理后黏度也顯著降低。但由圖3可知，相比于溫度與時(shí)間因素對(duì)酪蛋白表觀黏度影響，處理壓強(qiáng)對(duì)其影響更為顯著。當(dāng)壓強(qiáng)大于10 MPa 時(shí)，其表觀黏度急劇降低。乳制品的黏度與感官品質(zhì)之間存在相關(guān)關(guān)系[25]，過高或過低的黏度都不利于乳制品的加工，因此控制處理壓強(qiáng)是維持乳制品黏度的有效手段。

圖3 DPCD 對(duì)酪蛋白表觀黏度的影響Fig.3 The effect of DPCD treatment on viscosity profile of casein

2.3.4 乳化性 DPCD 對(duì)酪蛋白乳化活性（EAI）乳化穩(wěn)定性（ESI）影響如表2所示。乳化活性表征了乳劑形成過程中蛋白質(zhì)在油水界面快速吸附的能力[26]，由表2可知，總體上DPCD 處理降低了酪蛋白的乳化活性，這一現(xiàn)象可通過溶解度和表面疏水性變化解釋。蛋白質(zhì)乳化活性與其溶解度相關(guān)，DPCD 處理后酪蛋白較差的溶解性使其吸附于油水界面的分子數(shù)量減少，從而限制其乳化活性[27]。另外DPCD 對(duì)酪蛋白表面疏水性的修飾作用使其本身親水性/疏水性平衡被破壞，使酪蛋白在界面處的吸附能力降低，從而降低其乳化活性[28]。乳化穩(wěn)定性方面，DPCD 導(dǎo)致酪蛋白乳化穩(wěn)定性顯著降低（P<0.05），可歸因于由DPCD 引起的酪蛋白表觀黏度的下降導(dǎo)致分子分散于油水界面的穩(wěn)定性降低，不能有效阻止乳化液滴絮凝而使其乳化穩(wěn)定性下降。但隨著壓強(qiáng)升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，其乳化性存在輕微上升趨勢(shì)，這可能與酪蛋白溶液濁度變化有關(guān)。由此可見，DPCD 對(duì)酪蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性存在不利影響，一定程度上影響了酪蛋白的加工特性。

3 結(jié)論

DPCD 通過影響酪蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)來改變其物理特性，從而影響乳制品品質(zhì)。35 ℃條件下DPCD 將酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊，并增大其表面疏水性。但高溫與DPCD 的協(xié)同作用可引起酪蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)相反的變化?；谄鋵?duì)酪蛋白結(jié)構(gòu)影響，35℃條件下DPCD 可降低酪蛋白溶解度并且能對(duì)蛋白分子起輕微解離作用，但高溫處理?xiàng)l件下酪蛋白溶解度降低趨勢(shì)更明顯且更容易發(fā)生聚集而發(fā)生粒徑的突變。而DPCD 對(duì)酪蛋白流動(dòng)行為和界面特性影響表現(xiàn)在其引起酪蛋白表觀黏度和乳化性的降低?？偠灾邷乜稍鰪?qiáng)酪蛋白對(duì)DPCD 的敏感性而使其品質(zhì)更容易被破壞，因此用DPCD 對(duì)乳制品進(jìn)行殺菌時(shí)低溫（35 ℃）處理能有效維持酪蛋白的物理特性。然而，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，還需和DPCD 的殺菌效果以及能耗相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在充分殺菌的同時(shí)，最低限度地影響乳制品品質(zhì)。