郭坤杰，何 靜，吉日木圖，2*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 呼和浩特 010018 2 內(nèi)蒙古駱駝研究院 內(nèi)蒙古阿拉善 750306）

炎性腸病 （Inflammatory bowel disease，IBD）主要包括克羅恩?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），而UC 是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病。在UC 中，病變主要在直腸和結(jié)腸發(fā)生，導(dǎo)致腸上皮表面損傷；而CD 在胃腸道的任何部位均可發(fā)生[1]。兩者的臨床癥狀都涉及腹痛、腸道出血、便血、體重減輕和腹瀉等。目前IBD 的病因尚未完全明確，可歸因于與遺傳、免疫和環(huán)境因素有關(guān)[2-3]。有研究表明，其發(fā)病機制主要包括腸上皮屏障破壞、固有免疫防御失控和腸道微生物失調(diào)[4-5]。近年來，IBD 發(fā)病率逐年攀升，無法徹底根治。越來越多的人喜歡通過天然食物來預(yù)防結(jié)腸炎[6]。

駱駝乳（camel milk，CM）具有多種生物活性成分，因具有多種保健功能而被廣泛食用，被作為一種基本營養(yǎng)補充劑來幫助免疫缺陷患者[7]。與其它反芻動物乳相比，CM 還可以被乳糖不耐受患者和牛奶過敏患者食用[8]，其脂肪、膽固醇和乳糖含量低，鈣、鎂、銅、鋅等礦物質(zhì)含量高，維生素A、B2、C、E 等含量高[9]。除了分泌型IgA 和IgM 的含量高外，CM 還含有多種抗菌和抗病毒活性的納米抗體，并含有多種具有免疫調(diào)節(jié)特性的生物活性蛋白，包括溶菌酶、乳糖過氧化物酶和N-乙酰氨基葡萄糖酶[10]。此外，CM 中含有低聚糖，低聚糖是一種益生元，它可以減少致病性微生物附著于結(jié)腸黏膜并有利于雙歧桿菌數(shù)量增加。同時，CM 富含乳鐵蛋白，具有較好的抗氧化和抗炎特性。據(jù)報道，CM 對糖尿病[11-12]、腎病[13]和酒精性肝損傷[14-15]具有保護和減輕作用。然而，關(guān)于CM 對IBD 保護作用的研究還很有限。本研究旨在探究CM 對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳，內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善右旗所屬的牧區(qū)。

試驗動物購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，6～8 周雄性C57BL/6 小鼠60 只 （許可證編號：SCXK（京）2016-0001，SPF 級）；飼料購于北京科澳協(xié)力公司。

葡聚糖硫酸鈉，美國MPBiomedicals 公司；白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、白介素10（IL-10）、脂多糖（LPS）和髓過氧化物酶（MPO）ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；石蠟、甲醛、二甲苯，上海國藥集團；動物組織總RNA 提取試劑盒，成都福際生物技術(shù)有限公司；中性樹脂，北京索萊寶公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，蘇州宇恒生物科技有限公司；SYBR Green 熒光定量PCR，蘇州宇恒生物科技有限公司；蘇木素、伊紅，BASO 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio Tack 酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；ZJ-4IVC 動物實驗系統(tǒng)，蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機，德國Eppencbrf 公司；實時熒光定量PCR 儀，瑞士Roche 公司；PCR 儀，美國賽默飛世爾科技公司；2014-181Ab 真空冷凍干燥機，上海東富龍科技股份有限公司；Bead Ruptor 24 Elit 多功能生物樣品均質(zhì)器，美國Omni International 公司；GHP-9270 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；各型號微量加樣器，德國Eppencbrf 公司。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)腸炎小鼠模型的構(gòu)建和分組 6～8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，飼養(yǎng)于清潔級動物房，適應(yīng)環(huán)境1 周，喂食普通飼料，自由進食及飲水。將60 只小鼠隨機分成空白組、模型組、CM 組和CM+DSS組（見圖1）?？瞻捉M和模型組，連續(xù)灌胃生理鹽水21 d，從第15～21 天開始，模型組自由飲用2.5%DSS 溶液；CM 組和CM+DSS 組，連續(xù)灌胃CM 21 d，從第15～21 天開始，CM+DSS 組自由飲用2.5%DSS 溶液。試驗結(jié)束后處死小鼠，收集小鼠的結(jié)腸組織、血清和糞便。血清和一半結(jié)腸在-80 ℃保存，另一半結(jié)腸固定在4%緩沖甲醛中進行組織學(xué)觀察。

圖1 各組小鼠處理方案示意圖Fig.1 Schematic diagram of the treatment plan of each group of mice

1.3.2 疾病活動指數(shù)評價組織病理學(xué)評分 如表1所示，按照Hamamoto 等[16]標準計算各組小鼠的DAI 評分，每日稱重，觀察大便性狀和隱血情況。

表1 DAI 評分表Table 1 DAI score sheet

體重變化率=（起始體重-試驗當(dāng)天體重）/起始體重×100%

DAI=大便性狀+大便隱血+體重下降

1.3.3 組織病理學(xué)評分 結(jié)腸通過4%多聚甲醛進行固定，脫水透明，石蠟包埋后，切片、脫蠟和蘇木精-伊紅 （hematoxylin-eosin staining，H&E）染色，透明并封片，鏡檢觀察。如表2所示，根據(jù)Cooper 標準計算病理組織學(xué)評分[17]。

表2 組織病理學(xué)評分表Table 2 Histopathology score sheet

1.3.4 TUNEL 法檢測細胞凋亡 先將組織切片進行脫蠟，然后將稀釋后的蛋白酶K 滴加至切片37 ℃，PBS 洗滌3 次；滴加50 μL 檢測液，37 ℃孵育60 min，PBS 洗滌3 次；滴加10 μg/mL Hoechst 33342 孵育1 min，PBS 洗滌3 次；使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 免疫組織化學(xué)檢測緊密連接蛋白的表達 先將切片進行脫蠟水化，再進行高壓抗原修復(fù)，使用3%的H2O2去離子水37 ℃孵育，PBS 洗滌3次；采用山羊血清孵育30 min，然后滴加一抗4 ℃過夜，PBS 洗滌3 次，滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次。使用DAB 顯色，并用蘇木素進行復(fù)染，中性樹膠封片，胞漿呈黃色細顆粒狀則判斷為陽性產(chǎn)物，用電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 MPO 活性及血清IL-1β、IL-6 和IL-10 含量的檢測 取結(jié)腸組織勻漿于pH 7.4 PBS 緩沖液中，14 000 g，4 ℃離心15 min，收集上清液。小鼠眼球取血后，室溫放置3～4 h，3 000 r/min 20 min離心，收集上清，-80 ℃保存作進一步分析。結(jié)腸MPO 活性及血清IL-1β、IL-6 和IL-10 含量檢測按照上海酶聯(lián)試劑盒說明書進行測定。

1.3.7 實時熒光定量PCR 檢測結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6 和IL-10 的mRNA 水平 取小鼠結(jié)腸組織提取RNA，按照Animal Total RNA Isolation Kit 說明書方法操作，并測定總RNA 濃度及純度；按照UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis 說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA后于-20 ℃保存。引物基因序列由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。引物序列見表3。依據(jù)2-ΔΔCT法計算mRNA 的表達。每個樣本設(shè)置為3 個復(fù)孔，總反應(yīng)體系為20 μL，其反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s。根據(jù)樣本CT值做相關(guān)計算，根據(jù)熔解曲線判斷PCR 產(chǎn)物是否具有特異性。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

通過SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)間差異顯著水平進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)都以±s 表示，P<0.05 為統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。圖表采用Graphpad 6.01 軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重和DAI 變化

研究表明，DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎與人類的IBD 癥狀相似[18]。處死小鼠前，每天對各組小鼠進行稱重，每組小鼠體重?zé)o顯著差異。如圖2所示，隨2.5% DSS 的飲用，空白組和CM 組小鼠體重每天緩慢增長，模型組和CM+DSS 組均表現(xiàn)出體重下降趨勢，到第7 天時分別下降了14.2%和6.1%。與空白組相比，模型組小鼠從第4 天開始體重變化率具有顯著差異 （P<0.05）。相比模型組，CM+DSS 組小鼠體重下降程度相對減小，且后期下降趨勢減緩，從第4 天開始體重變化率具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），表明CM 干預(yù)后可以緩解結(jié)腸炎小鼠體重減輕癥狀。

圖2 駝乳對結(jié)腸炎小鼠體重變化率和DAI 評分的影響Fig.2 The effect of camel milk on the weight change rate and DAI score of colitis mice

在處死小鼠前1 天，DAI 評分由觀察者通過結(jié)合體重變化情況、大便隱血和性狀等情況綜合性進行評估。除體重外，隨DSS 的飲用模型組和CM+DSS 組的飲食和飲水量也開始減少，且第3天時小鼠開始腹瀉，第4 天時逐漸開始便血。從第2 天開始，與空白組相比，模型組DAI 評分具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），至第7 天DAI 評分達到最高，高達9.6 分。與模型組相比，CM+DSS 組DAI 評分均低于模型組（P<0.05），到第7 天時評分為6.1 分，且增加幅度相對緩慢，從第4 天開始與模型組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異 （P<0.05）。此外，補充CM 緩解了結(jié)腸炎小鼠的其它病理學(xué)特征，包括大便隱血和腹瀉。

2.2 結(jié)腸長度和病理組學(xué)評分

解剖小鼠后，取出結(jié)腸組織觀察結(jié)腸長度變化。結(jié)腸長度變化是衡量炎癥的一個重要標準，炎癥加劇，結(jié)腸會腫脹縮短。如圖3所示，空白組小鼠結(jié)腸組織長度最長，表面光滑且未見腫脹，腸內(nèi)糞便成型，而模型組結(jié)腸長度最短，與空白組結(jié)腸長度相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），且表現(xiàn)出明顯水腫，腸內(nèi)糞便呈黃色水樣膿液。通過CM干預(yù)后，結(jié)腸縮短情況有所緩解，CM+DSS 組小鼠結(jié)腸長度與模型組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），表明CM 可以緩解結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸縮短的癥狀。

圖3 駝乳對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響Fig.3 The effect of camel milk on the colon length of mice with colitis

如圖4所示，通過H&E 染色結(jié)果表明，空白組和CM 組小鼠結(jié)腸組織腺體排列整齊，結(jié)腸黏膜完整，隱窩正常，未見病變；模型組小鼠結(jié)腸組織腺體排列紊亂，腸黏膜被破壞，彌漫性溶解壞死，隱窩和杯狀細胞明顯減少，炎性細胞浸潤情況嚴重，病變嚴重，導(dǎo)致組織損傷評分顯著升高，與空白組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異 （P<0.05）；CM+DSS 組小鼠結(jié)腸組織黏膜破壞程度減少，組織較完整，小部分腺體缺失，炎性細胞浸潤少，炎癥程度較模型組減輕，組織損傷評分降低，與模型組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），表明CM可以明顯改善結(jié)腸炎小鼠的組織損傷情況。

圖4 小鼠結(jié)腸組織HE 染色病理圖及組織損傷評分Fig.4 HE staining pathology and tissue damage score of mouse colon tissue

2.3 TUNEL 法檢測腸上皮細胞凋亡

腸上皮細胞的凋亡和增殖是維持腸道內(nèi)緩解穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[19]。由病理切片結(jié)果得知結(jié)腸炎小鼠腸黏膜被破壞，因此通過TUNEL 法進一步檢測腸上皮細胞的凋亡情況，探討CM 是否通過調(diào)節(jié)細胞凋亡來維持上皮的完整性。如圖5所示，TUNEL檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組和CM 組小鼠結(jié)腸上皮組織無細胞凋亡特征；模型組小鼠腸上皮組織伴有組織損傷的細胞凋亡特征，細胞凋亡數(shù)最多；CM+DSS 組小鼠腸上皮組織細胞凋亡明顯減少，說明CM 可能通過抑制腸上皮細胞凋亡來改善腸道屏障功能的完整性。

圖5 駝乳對結(jié)腸炎小鼠組織細胞凋亡的影響Fig.5 The effect of camel milk on cell apoptosis in mice with colitis

2.4 緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 和ZO-1 的表達

由于腸上皮黏液層是抵御病原體入侵的第一道防線，其功能在很大程度上依賴于細胞間緊密連接，因此檢測了緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 和ZO-1 在結(jié)腸組織中的表達與分布。如圖6、圖7和圖8，免疫組化染色結(jié)果所示，在空白組和CM 組中Claudin-1、Occludin 和ZO-1 的表達量較高，主要分布在腸上皮細胞頂端的表面與隱窩之間，排列整齊，呈連續(xù)性分布；在模型組中Claudin-1、Occludin 和ZO-1 的表達量明顯減少，還有少量陽性細胞，排列紊亂，呈不連續(xù)性分布，部分區(qū)域出現(xiàn)完全丟失的情況；在CM+DSS 組中Claudin-1、Occludin 和ZO-1 的表達量和陽性細胞數(shù)量顯著高于模型組。

圖6 各組小鼠結(jié)腸組織中Claudin-1 蛋白的免疫組化染色Fig.6 Immunohistochemical staining of Claudin-1 protein in the colon tissue of mice in each group

圖7 各組小鼠結(jié)腸組織中Occludin 蛋白的免疫組化染色Fig.7 Immunohistochemical staining of Occludin protein in the colon tissue of mice in each group

圖8 各組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1 蛋白的免疫組化染色Fig.8 Immunohistochemical staining of ZO-1 protein in colon tissue of mice in each group

2.5 小鼠結(jié)腸MPO 活性及血清IL-1β、IL-6 和IL-10 含量

MPO 是中性粒細胞浸潤的重要標志。如圖9所示，飲用2.5% DSS 后，模型組小鼠的結(jié)腸MPO活性最高，與空白組相比具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。通過駝乳干預(yù)后，CM+DSS 組的MPO活性明顯低于模型組，且與模型組具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），表明CM 可能通過減少炎性細胞的浸潤從而改善炎癥。

圖9 駝乳對結(jié)腸炎小鼠血清炎性細胞因子含量的影響Fig.9 The effect of camel milk on serum inflammatory cytokine levels in colitis mice

ELISA 檢測結(jié)果所示，與空白組相比，模型組小鼠中結(jié)腸組織的炎性細胞因子IL-6、IL-10 和IL-1β 水平升高，且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），表明模型組小鼠具有炎癥；通過駝乳干預(yù)后，CM+DSS 組小鼠結(jié)腸組織中的炎性細胞因子水平明顯下調(diào)（P<0.05），且與模型組具有顯著的

統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），水平接近空白組，表明CM可能通過降低炎性細胞因子水平從而抑制炎癥。此外，空白組與CM 組之間沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

2.6 實時熒光定量PCR 檢測結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6 和IL-10 的mRNA 水平

為進一步確定CM 對DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的保護作用，檢測的典型促炎細胞因子IL-1β 和IL-6 以及抗炎細胞因子IL-10 在結(jié)腸組織中mRNA的相對表達量。如圖10a 所示，與空白組相比，模型組具有最高豐度的IL-6 mRNA，且與空白組具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），而CM+DSS 組小鼠的IL-6 mRNA 水平顯著低于模型組（P<0.05）。如圖10b 所示，空白組和CM 組的IL-10 mRNA表達量相對較小，而模型組的IL-10 mRNA 水平達到最高，且與空白組具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。與模型組相比，CM+DSS 組的IL-10 mRNA水平顯著低于模型組（P<0.05）。如圖10c 所示，空白組和CM 組的IL-1β mRNA 相對表達量較小，而模型組具有最高豐度的IL-1β mRNA，且與空白組具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。與模型組相比，CM+DSS 組小鼠的IL-1β mRNA 水平顯著降低（P<0.05）。

圖10 駝乳對結(jié)腸炎小鼠炎性細胞因子的mRNA 影響Fig.10 The effect of camel milk on the mRNA of inflammatory cytokines in mice with colitis

3 討論

駝乳是一種重要的膳食補充劑，可以維持身體健康，增強體力，提高疾病預(yù)防能力[7]。本研究表明，DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠會出現(xiàn)食欲不振、體重下降、腹瀉、便血和結(jié)腸縮短等癥狀[20-21]。本試驗通過給小鼠自由飲用含2.5% DSS 的水進行造模，連續(xù)飲用7 d，在第3 天開始出現(xiàn)腹瀉，第4 天開始出現(xiàn)便血癥狀，直至第7 天時小鼠結(jié)腸炎癥狀加重。解剖后，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織明顯水腫充血，長度縮短，HE 染色發(fā)現(xiàn)腸上皮黏膜被破壞、腺體排列紊亂、隱窩消失和炎性細胞浸潤等癥狀。而通過CM 干預(yù)的小鼠，上述癥狀均有所改善。在改善結(jié)腸損傷的同時，駝乳還減少了腸上皮細胞的凋亡以及緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 和ZO-1 的缺失。因此，本研究推測CM 的保護作用歸因于它的抗炎特性。

先前有研究表明，降低炎性細胞因子水平是治療IBD 的一個重要指標[22]，如TNF-α、IL-6、IL-1β 和IL-10 在IBD 的形成中起主導(dǎo)作用。此外，這些炎性細胞因子的基因都有NF-κB 的結(jié)合位點，并受這些因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[23]。經(jīng)本研究證實CM 干預(yù)后可明顯降低促炎細胞因子IL-6 和IL-1β 水平，從而有效減緩IBD 癥狀。同時，本研究結(jié)果顯示，隨DSS 飲用抗炎細胞因子IL-10 水升高。雖然之前有研究報道結(jié)腸炎小鼠的IL-10 水平降低[24]，但仍有研究表明在IBD 患者以及TNBS 和DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中存在IL-10 水平升高的情況[25]。Barada 等[25]研究指出，在誘導(dǎo)結(jié)腸炎3 h后IL-10 水平就開始升高，1 周后達到高峰，3 周后升高4.5 倍。由于IL-10 可以下調(diào)MHC II 類抗原呈遞和促炎細胞因子如TNF-a、IL-1β 和IL-6，所以認為IL-10 水平升高是一種對結(jié)腸損傷的代償機制，可以抑制黏膜炎癥。

經(jīng)Su 等[26]研究證實，腸上皮屏障破壞也是IBD 形成的重要因素之一，屏障功能受損后，黏膜免疫系統(tǒng)暴露于腸內(nèi)微生物，導(dǎo)致細菌和其它抗原進入，從而進一步擴大炎癥。腸上皮細胞如分泌黏液并產(chǎn)生三葉草因子的杯狀細胞和產(chǎn)生抗菌肽和生長因子的潘氏細胞[27]，其分泌物共同構(gòu)成保護性黏液層，是發(fā)揮腸屏障功能的關(guān)鍵。因此，維持腸上皮屏障的緊密性和完整性也是IBD 治療的重要目標[28]。諸多研究證實，緊密連接蛋白如ZO-1、Occlutdin 和Claudin-1 與上皮屏障功能受損有關(guān)，其中ZO-1 是緊密連接中的主要蛋白，與腸上皮完整性相關(guān)[29]，可作為腸道機械屏障的標志物。Occludin 對緊密連接穩(wěn)定性和屏障功能十分重要[30]。Claudin-1 是一種完整的膜蛋白，是緊密連接鏈的組成部分[31]。本研究通過免疫組化檢測緊密連接蛋白表達，結(jié)果表明，CM+DSS 組的緊密連接蛋白表達量顯著增加。此外，越來越多的研究表明，腸上皮細胞凋亡參與了UC 的形成過程，并與IBD 的發(fā)病機制有關(guān)[32-33]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠促進腸上皮細胞凋亡，導(dǎo)致腸道屏障破壞，易受微生物感染。相反，CM 干預(yù)后小鼠腸上皮細胞凋亡明顯減少，推測可能通過抑制細胞凋亡對腸道屏障起到保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示CM 能夠通過調(diào)節(jié)腸道通透性、緊密連接蛋白表達等方式來緩解DSS 對小鼠結(jié)腸機械屏障的破壞，通過抑制炎性細胞因子的分泌來緩解結(jié)腸的炎癥反應(yīng)，實現(xiàn)對腸黏膜屏障的保護作用。