劉鋒鋒，鄭建杰，劉淼淼

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科，陜西 西安 710061)

暴發(fā)性心肌炎是由病毒感染、自身免疫性疾病、毒素/藥物毒性等原因?qū)е滦募⊙仔該p傷心臟功能受損，是心肌炎中最嚴重和特殊的類型，起病急驟，進展迅速，患者很快出現(xiàn)血液動力學(xué)異常和嚴重心律失常，早期病死率極高[1-2]。暴發(fā)性心肌炎患者出現(xiàn)異常免疫系統(tǒng)激活，導(dǎo)致免疫細胞向多個組織器官募集浸潤，細胞因子釋放和過度的免疫應(yīng)答所致的“細胞因子風暴”亦可造成多臟器功能衰竭(如：呼吸衰竭、肝功能衰竭、腎功能衰竭等)[3-4]。以生命支持為依托的綜合救治方案是暴發(fā)性心肌炎的中心環(huán)節(jié)[5]。體外膜肺氧合(Extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)是重要的呼吸循環(huán)支持手段，對暴發(fā)性心肌炎的救治中已獲得大量臨床數(shù)據(jù)支持[6-7]。但有關(guān)ECMO對暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達譜的影響罕見相關(guān)報道。因此，本研究首先分析了暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達譜，并觀察ECMO治療對暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本研究方案通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，入組患者法定監(jiān)護人、對照者均簽署知情同意書。入組2017年4月至2021年6月在我科就診的成人暴發(fā)性心肌炎患者28例，所有患者診斷均符合《成人暴發(fā)性心肌炎診斷與治療中國專家共識》[5]的標準，病例納入標準：①臨床表現(xiàn)包括短時間內(nèi)發(fā)生心慌、心悸、胸悶、胸痛、黑曚、暈厥、呼吸困難等；②心電圖檢查發(fā)現(xiàn)心律失常、ST段改變，心臟彩超檢查發(fā)現(xiàn)彌漫性室壁運動減低、收縮功能異常；③實驗室檢查發(fā)現(xiàn)多種心肌損傷標志物(包括：肌鈣蛋白Ⅰ、腦鈉肽、肌酸激酶同工酶MB)急性升高。排除標準：①有其他心臟病史(如：風濕性心臟病、先天性心臟病、心肌梗死等)；②惡性腫瘤患者；③合并慢性病毒感染者；④孕產(chǎn)婦。入組同時期在我院體檢中心進行健康查體的志愿者19例作為對照組。暴發(fā)性心肌炎組28例，男19例，女9例，年齡21～50歲，平均(37.9±8.2)歲。對照組19例，男12例，女7例，年齡19～51歲，平均(36.1±10.7)歲。兩組一般情況比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。所有暴發(fā)性心肌炎患者均接受ECMO治療，死亡6例，存活22例，存活率為78.57 %。存活患者ECMO治療時間為(105.7±11.9)h。在ECMO治療期間，并發(fā)癥包括出血3例，肺部感染2例，下肢血栓2例。

1.2 研究方法

1.2.1 主要儀器和試劑：ECMO為德國MAQUET Cardiopulmonary AG產(chǎn)品(型號規(guī)格：Rota Flow)；低溫離心機為美國Sigma公司產(chǎn)品；Luminex 200多功能液相芯片分析平臺為美國Millipore公司產(chǎn)品。14種細胞因子Luminex分析試劑盒(Human Cytokine Magnetic Luminex Performance Assay 14-Plex Fixed Panel)為美國R&D公司產(chǎn)品(貨號：LKTM011)。

1.2.2 ECMO操作過程：ECMO治療均選擇靜脈-動脈(V-A)輔助模式，采用普通肝素進行體外生命支持期間的抗凝控制。同側(cè)股動脈、股靜脈穿刺置入動脈插管17Fr和靜脈插管21Fr，膜式氧合器套包排氣后備用，將動靜脈連接管分別與穿刺置入好的股、動靜脈插管連接后開始轉(zhuǎn)流。股靜脈引出未經(jīng)氧合的血液，經(jīng)過離心泵和人工膜肺進行氧合后，經(jīng)股動脈輸入機體。所有患者股動脈插管側(cè)遠端置入灌注管，與股動脈插管三通側(cè)枝相連，作為旁路為遠端肢體供血，避免同側(cè)下肢遠端發(fā)生缺血壞死。使用ECMO的前48 h，流量設(shè)置為較高水平，輔助泵血流量達到患者理想心輸出量的80%，然后根據(jù)患者心臟恢復(fù)情況和血流動力學(xué)水平、心臟超聲檢測，適當下調(diào)泵血流量，達到患者理想心輸出量的50%。ECMO撤除前48 h，將泵血流量控制在患者理想心輸出量的20%～30%，并根據(jù)患者情況調(diào)整血管活性藥物用量。如心臟超聲提示患者心臟功能恢復(fù)、血壓、心率、及氧合平穩(wěn)，血管活性藥物劑量基本減停，ECMO輔助流量降低至1.3 L/min，維持12 h后，再次檢測上述指標平穩(wěn)后撤除ECMO輔助，繼續(xù)后期的常規(guī)治療。

1.2.3 血清分離：對照組于清晨空腹、暴發(fā)性心肌炎患者入院后和ECMO撤除后采集非抗凝外周血5 ml，靜置30 min后于4 ℃、1000 r/min離心15 min，收集上層血清，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞因子檢測：使用14種細胞因子Luminex分析試劑盒對血清中細胞因子進行檢測，包括：干擾素-α(Interferon-α,IFN-α)、IFN-γ、白細胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)、IL-1β、IL-1受體α(IL-1 receptor α,IL-1ra)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-33、血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)。向平板中加入50 μl稀釋的血清樣本和標準品，然后加入50 μl微粒雞尾酒(microparticle cocktail)，加蓋密封后水平搖床孵育2 h。洗滌3次，加入50 μl生物素抗體雞尾酒，加蓋密封后水平搖床孵育1 h。洗滌3次，加入50 μl鏈霉素-PE，加蓋密封后水平搖床孵育30 min。洗滌3次，加入100 μl洗滌緩沖液，水平搖床孵育2 min，加蓋密封后水平搖床孵育1 h。使用Luminex 200多功能液相芯片分析平臺讀板，根據(jù)標準曲線計算血清樣本中各種細胞因子水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)首先經(jīng)過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(四分位間距)[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗或Wilcoxon配對檢驗。受試工作者特征(ROC)曲線分析細胞因子預(yù)測暴發(fā)性心肌炎患者生存結(jié)局。所有檢驗均為雙側(cè)檢測，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達譜變化 暴發(fā)性心肌炎組和對照組血清中均未檢測到IL-3表達。IFN-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-4、IL-10、IL-33和VEGF水平在暴發(fā)性心肌炎組和對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，暴發(fā)性心肌炎患者血清IL-2、IL-6、IL-7和IL-15水平均顯著高于對照組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。對暴發(fā)性心肌炎組存活者和死亡者血清IL-2、IL-6、IL-7和IL-15進行ROC曲線分析，IL-2曲線下面積(AUC)為0.583，95%可信區(qū)間(CI)為0.347～0.820，P=0.538(圖1A)。IL-6 AUC為0.871，95%CI為0.740～1.002，P=0.006(圖1B)。IL-7 AUC為0.598，95%CI為0.371～0.826，P=0.467(圖1C)。IL-15 AUC為0.609，95%CI為0.408～0.811，P=0.417(圖1D)。IL-6的生存結(jié)局預(yù)測效能良好，IL-2、IL-7和IL-15的生存結(jié)局預(yù)測效能較差。

圖1 預(yù)測暴發(fā)性心肌炎預(yù)后的ROC曲線

2.2 暴發(fā)性心肌炎存活患者ECMO治療后血清細胞因子水平變化 22例存活的暴發(fā)性心肌炎患者在ECMO撤除后采集外周血，檢測血清中IL-2、IL-6、IL-7和IL-15水平。血清IL-2、IL-7和IL-15水平在基線和ECMO撤除后的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，血清IL-6水平在ECMO撤除后顯著低于基線，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 暴發(fā)性心肌炎存活患者ECMO治療后血清細胞因子水平變化(pg/ml)

3 討 論

成人暴發(fā)性心肌炎患者行ECMO治療的臨床效果顯著，可使機體組織灌注得到有效改善，提高救治成功率[8-10]。免疫因素參與了暴發(fā)性心肌炎等因素誘導(dǎo)的心肌損傷[11]，特別是病毒感染、自身免疫等因素造成的多種免疫細胞和免疫分子調(diào)控紊亂促進了暴發(fā)性心肌炎的疾病進程。部分危重型新型冠狀病毒病(Coronavirus disease 2019,COVID-19)患者亦可并發(fā)暴發(fā)性心肌炎，ECMO治療可有效降低心肌損傷[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECMO治療后暴發(fā)性心肌炎患者存活率為78.57 %，與既往報道結(jié)果相似[8-10]，進一步說明ECMO在暴發(fā)性心肌炎治療中的重要作用。

IL-6是一種多效性細胞因子，主要由活化的T細胞和成纖維細胞分泌，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期應(yīng)答、抗感染免疫等功能，特別是在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。柯薩奇病毒B3感染促進IL-6、IL-1β、IL-8等多種細胞因子分泌，促進中性粒細胞向心肌募集浸潤，誘導(dǎo)病毒性心肌炎發(fā)病[14]。完全弗氏佐劑在免疫應(yīng)答初期即可促進IL-6分泌，誘導(dǎo)自身免疫性心肌炎發(fā)病[15]。在一例COVID-19并發(fā)暴發(fā)性心肌炎患者中，疾病早期患者血清IL-6水平升高，接受機械通氣、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)治療、連續(xù)腎臟替代治療等綜合治療后患者肺部病變?nèi)匀贿M展，氧合無法維持，IL-6水平進一步升高。使用ECMO治療72 h后患者循環(huán)和氧合均改善，心肌損傷減輕，IL-6水平明顯下降[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴發(fā)性心肌炎患者血清IL-6水平顯著升高，ECMO治療后IL-6水平顯著降低，而IL-6水平升高亦為暴發(fā)性心肌炎患者臨床預(yù)后不良的重要影響因素之一。結(jié)合既往發(fā)表的結(jié)果，這說明IL-6參與了暴發(fā)性心肌炎的發(fā)病，而ECMO治療顯著降低了IL-6水平，抑制機體免疫應(yīng)答，促進患者病情恢復(fù)。

IL-2、IL-7和IL-15均屬于共同γ鏈細胞因子家族成員，有多種免疫細胞和成纖維細胞分泌，主要發(fā)揮促進T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、單核巨噬細胞活性的作用，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)、免疫網(wǎng)絡(luò)平衡中均發(fā)揮重要作用[16]。1例轉(zhuǎn)移性腎癌患者接受高劑量IL-2治療后出現(xiàn)急性進行性呼吸困難、肌鈣蛋白水平升高，導(dǎo)致急性心肌炎發(fā)生[17]，提示IL-2具有心臟毒性。心肌炎患者IL-7受體α鏈(即CD127)主要表達于巨噬細胞中，IL-7可作為重要的趨化因子，誘導(dǎo)巨噬細胞向心肌募集浸潤[18]。IL-15作為促炎因子，可發(fā)揮促進自然殺傷細胞功能的作用，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病促進動脈粥樣硬化形成，在心肌炎中則可誘導(dǎo)疾病進展[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴發(fā)性心肌炎患者血清IL-2、IL-7和IL-15水平均明顯升高，提示共同γ鏈細胞因子參與了暴發(fā)性心肌炎發(fā)病，但ECMO治療對IL-2、IL-7和IL-15水平均無顯著影響，而共同γ鏈細胞因子水平亦不能作為暴發(fā)性心肌炎患者的生存結(jié)局預(yù)測治療。這可能與暴發(fā)性心肌炎患者，特別是病毒感染誘導(dǎo)的暴發(fā)性心肌炎患者，經(jīng)有效治療后在恢復(fù)期仍存在免疫記憶有關(guān)[20]。

綜上所述，IL-6和多種共同γ鏈細胞因子參與了暴發(fā)性心肌炎的發(fā)病。ECMO治療可有效降低IL-6水平，但對共同γ鏈細胞因子水平無明顯影響，ECMO可能通過降低血清IL-6水平抑制暴發(fā)性心肌炎患者炎癥應(yīng)答，促進疾病恢復(fù)。