南武娟，文申英

(1.咸陽市第一人民醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.商洛市中心醫(yī)院，陜西 商洛 726000)

急性冠狀動脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是一組以冠狀動脈內(nèi)不穩(wěn)定的粥樣硬化斑塊破裂或侵襲、繼發(fā)閉塞性血栓而引發(fā)急性心肌缺血的臨床綜合征，主要包括急性ST段抬高性心肌梗死(ST-elevation myocardial infarction,STEMI)、急性非ST段抬高性心肌梗死(Non-ST-elevation myocardial infarction,NSTEMI)和不穩(wěn)定型心絞痛(Unstable angina,UA)，患者常表現(xiàn)為發(fā)作性胸悶、胸痛、心悸、心絞痛等，可導(dǎo)致心律失常、心力衰竭甚至猝死，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，嚴重威脅患者的生命健康[1-2]。既往研究[3-4]表明，巨噬細胞泡沫化是ACS發(fā)生發(fā)展的重要影響因素之一，當巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡被打破時，即可發(fā)生巨噬細胞泡沫化，從而導(dǎo)致ACS的發(fā)生。動脈粥樣硬化指數(shù)(Atherosclerosis Index,AI)是動脈粥樣硬化過程中一系列危險因子和保護因子的比值，臨床研究[5]認為，AI是全面衡量動脈粥樣硬化程度的重要指標，具有極高的臨床診療應(yīng)用價值。然而，關(guān)于AI與ACS及外周血巨噬細胞中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的相關(guān)性，目前鮮有研究報道。因此，本研究旨在探究 ACS模型大鼠外周血巨噬細胞中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)與AI的關(guān)系，以期為ACS的臨床鑒別診斷提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物： 選取10只8周齡健康雄性SPF級SD大鼠，體重180～200 g，購自陜西省食品藥品檢驗研究院，許可證號：SYXK(陜)2018-002，常規(guī)飼養(yǎng)于恒溫恒濕潔凈動物房，正常晝夜交替，自由飲食飲水。

1.1.2 主要試劑及儀器：鹽酸異丙腎上腺素注射液(國藥準字H31021344);RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；超低溫冰箱、細胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；電子天平(METTLERTOLEDO公司)；石蠟組織切片機(德國萊卡公司)；光學(xué)顯微鏡(尼康儀器有限公司)；全自動酶標儀(Finnpipette公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及ACS模型建立：將20只大鼠隨機分為對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠頭部和四肢多點皮下注射30 mg/kg鹽酸異丙腎上腺素建立ACS模型，以心電圖發(fā)生改變?yōu)樵炷３晒藴剩粚φ战M大鼠給予皮下注射等體積生理鹽水。

1.2.2 取樣及處理：造模成功后6 h頸椎脫臼處死兩組大鼠，碘伏常規(guī)消毒，打開胸腔，斷開肋骨，無菌操作取出整個心臟和主動脈，以冰冷的無菌PBS沖洗，稱重后置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 心肌和主動脈組織形態(tài)學(xué)觀察：取兩組大鼠部分心肌和主動脈組織，10%甲醛溶液固定，乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切5 μm厚連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌和主動脈組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 心肌梗死面積比例和易損指數(shù)：取兩組大鼠部分心肌組織病理切片并稱重，沿白色梗死區(qū)域邊緣切下梗死的心肌組織，稱重，以梗死心肌組織的重量與整個心肌組織的重量之比表示心肌梗死面積比例。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件定量測算細胞外脂質(zhì)、泡沫細胞及膠原成分的含量，并按下述公式計算易損指數(shù)：易損指數(shù)=細胞外脂質(zhì)+泡沫細胞/平滑肌細胞+膠原。

1.2.5 外周血巨噬細胞中脂質(zhì)含量的測定：各只眼眶取血4 ml，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，待細胞貼壁生長后倒掉培養(yǎng)基，加適量無菌PBS輕輕洗去懸浮的細胞，再以胰蛋白酶消化并吹打重懸細胞，轉(zhuǎn)移至離心管，1000 r/min離心5 min，吸棄上清，以培養(yǎng)基重懸沉淀的巨噬細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，應(yīng)用全自動酶標儀于492 nm波長下檢測總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 和高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的含量。

1.2.6 AI值的計算：按下述公式計算AI：AI=non-HDL-C/HDL-C，其中non-HDL-C=TC-HDL-C。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 模型組大鼠均成功建立ACS模型，心電圖見圖1。造模后模型組大鼠生命體征均表現(xiàn)穩(wěn)定，兩組大鼠均精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光亮，體重穩(wěn)定，飲食飲水正常，實驗期間均未發(fā)生死亡。

2.2 兩組大鼠心肌和主動脈組織形態(tài)學(xué) HE染色可見模型組大鼠心肌纖維和間質(zhì)壞死，心肌細胞核呈碎裂或變性狀改變，大量炎性細胞浸潤，間質(zhì)水腫；主動脈壁內(nèi)有大量脂質(zhì)和鈣鹽沉積，內(nèi)膜明顯增厚，可見大量泡沫細胞，平滑肌細胞排列紊亂。對照組大鼠心肌組織形態(tài)基本正常，可見極少量炎性細胞浸潤，心肌細胞胞漿染色均勻；主動脈壁內(nèi)膜無增厚，未見脂質(zhì)沉積和泡沫細胞。見圖2。

A：對照組心臟；B：模型組心臟；C：對照組主動脈；D：模型組主動脈

2.3 兩組大鼠心肌梗死面積比例和易損指數(shù)比較 模型組大鼠心肌梗死面積比例和易損指數(shù)均顯著高于對照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠心肌梗死面積比例和易損指數(shù)比較

2.4 兩組大鼠外周血巨噬細胞中脂質(zhì)表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠外周血巨噬細胞中TC、TG和LDL-C表達水平均較高，而HDL-C表達水平較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠外周血巨噬細胞中脂質(zhì)表達水平比較(mmol/L)

2.5 各組大鼠non-HDL-C和AI值比較 與對照組比較，模型組大鼠的non-HDL-C和AI值均較高(均P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 各組大鼠non-HDL-C和AI值比較

2.6 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，ACS大鼠AI值與外周血巨噬細胞中TC(r=0.627，P<0.001)、TG(r=0.438，P<0.001)和LDL-C(r=0.699，P<0.001)呈正相關(guān)，與HDL-C(r=-0.521，P<0.001)呈負相關(guān)，見表4。

表4 相關(guān)性分析

2.7 多元線性回歸分析 將上述各指標作為自變量、AI值為因變量納入多元線性回歸分析，結(jié)果表明，TC(β=0.616，P<0.001)、TG(β=0.215，P<0.001)、LDL-C(β=0.757，P<0.001)和HDL-C(β=-0.255，P<0.001)是AI值的獨立影響因素，見表5。

表5 多元線性回歸分析

3 討 論

ACS的病理機制主要為動脈粥樣硬化易損斑塊的破裂、血栓的形成以及血管痙攣，具有極高的致殘率和致死率，是嚴重威脅患者生命健康的心血管急危重癥[6]，因此及早診斷和干預(yù)對于ACS的預(yù)防和治療具有至關(guān)重要的意義。

本研究采用頭部和四肢多點皮下注射鹽酸異丙腎上腺素的方法建立了ACS大鼠模型，并以心電圖檢查確認造模成功。HE染色可見，與對照組大鼠相比，模型組大鼠出現(xiàn)心肌纖維和間質(zhì)壞死，心肌細胞核呈碎裂或變性狀改變，大量炎性細胞浸潤，間質(zhì)水腫；主動脈壁內(nèi)有大量脂質(zhì)和鈣鹽沉積，內(nèi)膜明顯增厚，可見大量泡沫細胞，平滑肌細胞排列紊亂，提示模型組大鼠出現(xiàn)了較為嚴重的動脈粥樣硬化癥狀。通過計算大鼠心肌梗死面積比例發(fā)現(xiàn)，模型組顯著高于對照組，同樣提示ACS造模成功。易損斑塊的穩(wěn)定性是影響ACS發(fā)生發(fā)展的重要決定性因素[7-8]，易損斑塊的破裂所導(dǎo)致的血栓是ACS發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)，易損指數(shù)是綜合評價動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的參數(shù)之一，該參數(shù)將泡沫細胞和細胞外脂質(zhì)等脂質(zhì)成分與平滑肌細胞和膠原纖維等纖維肌性成分相結(jié)合，可更為客觀、全面的衡量斑塊的穩(wěn)定性[9-11]，本研究中模型組大鼠的易損指數(shù)顯著高于對照組，提示ACS模型大鼠斑塊較為不穩(wěn)定，可能存在較多的易損斑塊。上述結(jié)果均提示模型組大鼠出現(xiàn)了典型的ACS癥狀。

巨噬細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是指巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的動態(tài)平衡，當該平衡受外界因素影響或細胞因子的調(diào)控而被打破時，尤其是當胞內(nèi)脂質(zhì)含量增多時，胞內(nèi)脂質(zhì)累積即可引發(fā)巨噬細胞泡沫化，而后者為影響ACS發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[12-14]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，高膽固醇飼料喂養(yǎng)的大鼠更易誘發(fā)動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)或ACS模型，說明脂質(zhì)攝取和代謝的穩(wěn)態(tài)在此類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[15]。另有研究[16]證實，TC和LDL-C的增加，以及HDL-C的減少，導(dǎo)致LDL-C/HDL-C比值的升高，是ACS最基本的致病原因之一。LDL-C一方面可慢性炎癥損傷血管內(nèi)皮功能，和單核細胞進入內(nèi)皮下被氧化修飾為ox-LDL和巨噬細胞；另一方面，LDL-C可和各類炎癥因子、單核細胞等聚集于內(nèi)皮表面，產(chǎn)生黏附分子和多種細胞因子，進一步加重對內(nèi)皮功能的損傷，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致ACS及AS等疾病的發(fā)生。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)冠脈病變與LDL-C的關(guān)聯(lián)并非線性的，極低密度脂蛋白膽固醇(Very low density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)在TG≥200 mg/dl時被降解而間接引起LDL-C的升高，被巨噬細胞吞噬而導(dǎo)致巨噬細胞泡沫化，從而促進AS的進程。AI為TC與HDL-C含量的差值除以HDL-C，包含了所有與動脈硬化相關(guān)的脂質(zhì)成分，可反映脂質(zhì)中危險成分與保護成分的比值，是衡量動脈粥樣硬化程度的重要指標[17]。LDL-C已在既往研究[17]中被證實與冠狀動脈心臟病的發(fā)生密切相關(guān)，是冠狀動脈病理性改變的重要危險因素之一。然而近年來的研究[18]認為，AI可作為LDL-C小而密的替代性參數(shù)，可能成為臨床診斷ACS的新型指標之一。

本研究中，模型組大鼠外周血巨噬細胞中TC、TG和LDL-C的表達水平均顯著高于對照組，而HDL-C的表達水平顯著低于對照組，提示巨噬細胞中脂質(zhì)的表達動態(tài)平衡可能與ACS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；同時，模型組大鼠的non-HDL-C和AI值均顯著高于對照組，提示巨噬細胞中脂質(zhì)的表達水平可能與AI值存在一定關(guān)聯(lián)。進一步的Pearson相關(guān)性分析表明，ACS大鼠的AI值與外周血巨噬細胞中TC(r=0.627，P<0.001)、TG(r=0.438，P<0.001)和LDL-C(r=0.699，P<0.001)呈正相關(guān)，與HDL-C(r=-0.521，P<0.001)呈負相關(guān)；多元線性回歸分析結(jié)果顯示，TC(β=0.616，P<0.001)、TG(β=0.215，P<0.001)、LDL-C(β=0.757，P<0.001)和HDL-C(β=-0.255，P<0.001)是AI值的獨立影響因素，進一步揭示了ACS大鼠外周血巨噬細胞中脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)與AI值密切相關(guān)。張海波等[19]的研究同樣表明，脂代謝異常與ACS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，血栓的形成與TC/HDL-C比值的升高關(guān)系密切，ACS患者TC顯著升高、HDL-C顯著降低，同時AI值顯著升高，AI與ACS具有明顯的相關(guān)性，可作為ACS的獨立危險因素之一。金雷等[20]的研究亦證實，冠狀動脈心臟病患者的non-HDL-C與AI值呈正相關(guān)，將AI與常規(guī)生化指標聯(lián)合應(yīng)用，可更好的評估冠脈病變情況，為冠狀動脈心臟病的及早診治提供一定的支持。

綜上所述，本研究表明，ACS模型大鼠外周血巨噬細胞中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)與AI密切相關(guān)，TC、TG、LDL-C和HDL-C是AI值的獨立影響因素。然而，本研究僅揭示了ACS模型大鼠外周血巨噬細胞中脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)與AI值的關(guān)聯(lián)，其與ACS發(fā)生發(fā)展的具體作用機制的關(guān)系仍有待進一步深入探究。