嚴(yán)其高 祁冰潔 劉慧娟 劉金林 劉 毅

安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽安慶 246052

迄今為止，毛囊再生的機(jī)制尚未完全闡明，“隆突激活學(xué)說”認(rèn)為，休止期末的毛乳頭緊鄰毛囊干細(xì)胞并向其釋放激活信號，毛囊干細(xì)胞激活而啟動后，毛囊由休止期進(jìn)入生長期［1］。毛囊干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能，可以形成毛囊，也可以參與到表皮的更新過程中，對于毛囊的周期性生長、毛囊再生、皮膚傷口修復(fù)均具有重要作用［2］。由此可見，關(guān)于毛囊干細(xì)胞增殖、遷移、分化的研究是探討毛囊周期性發(fā)育調(diào)控的基礎(chǔ)。微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）通過結(jié)合靶基因3＇UTR 區(qū)域并發(fā)揮降解信使（mRNA）作用，同時(shí)抑制翻譯進(jìn)程，從而調(diào)控靶基因表達(dá)的非編碼miRNA［3］。以往研究毛囊干細(xì)胞增殖分化過程的文獻(xiàn)，主要通過單一“轉(zhuǎn)錄組”進(jìn)行相關(guān)研究，關(guān)于miRNA與mRNA之間相互關(guān)系的研究較少，關(guān)于調(diào)節(jié)毛囊干細(xì)胞增殖分化的miRNA 以及探討miRNA在毛囊干細(xì)胞增殖分化過程中相關(guān)分子機(jī)制的研究均較少。因此本研究探討miR-22-5P對毛囊干細(xì)胞增殖和分化的影響，并通過檢測相關(guān)信號通路的關(guān)鍵蛋白，分析在毛囊干細(xì)胞周期循環(huán)中miR-22-5P的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：來自于內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離純化的內(nèi)蒙古絨山羊毛囊干細(xì)胞所建立的P3代絨山羊毛囊干細(xì)胞系。

試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰蛋白酶購于美國Gibco 公司；CCK8、EdU、細(xì)胞周期檢測試劑盒購于上海生工有限公司；定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測試劑盒購于美國Thermo Fisher 公司；Western blot檢測所用抗體及相關(guān)試劑盒均購于美國Bioworld公司。

儀器：PCR儀、酶標(biāo)儀、超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱為美國Thermo 公司生產(chǎn)；冷凍離心機(jī)、高速離心機(jī)、PCR 基因擴(kuò)增儀為美國BD bioscience 公司生產(chǎn)；電泳儀、核酸定量儀為美國Bio-Rad 公司生產(chǎn)。凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。熒光顯微鏡、倒置顯微鏡為美國AMG公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞處理及分組

將P3 代毛囊干細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞生長到60% ~ 70%匯合時(shí)，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，加入24 孔板中，每孔1 × 104個細(xì)胞接種。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長貼壁后進(jìn)行分組。分為空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組、miR-22-5P轉(zhuǎn)染組?？瞻讓φ战M未作處理；空白轉(zhuǎn)染組使用miR-NC 轉(zhuǎn) 染；miR-22-5P 轉(zhuǎn) 染 組 使 用miR-22-5P mimics進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：將接種于24孔板中的毛囊干細(xì)胞加入配置好的轉(zhuǎn)染劑，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h。吸出轉(zhuǎn)染試劑后，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 方法

1.3.1 CCK8 檢測毛囊干細(xì)胞增殖活性 收集各組對數(shù)生長期毛囊干細(xì)胞，將1×104個細(xì)胞接種于96孔板中，分別于接種后24 h向各孔中加入CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h，振蕩混勻，酶標(biāo)儀上讀取450 nm波長處吸光光度值（optical density，OD）。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞活力值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞活力（%）=［A（處理組）-A（空白組）］/［A（未處理組）-A（空白組）］×100%。

1.3.2 EdU 實(shí)驗(yàn)檢測毛囊干細(xì)胞增殖情況 收集各組對數(shù)生長期毛囊干細(xì)胞，接種至24 孔板中，去除培養(yǎng)基后，經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，0.3%TritonX-100 作用15 min，加入EdU 檢測試劑盒中的反應(yīng)液，37 ℃避光孵育30 min，復(fù)染后，熒光顯微鏡拍照。經(jīng)Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過計(jì)算EdU陽性細(xì)胞比值分析細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞法進(jìn)行細(xì)胞周期檢測 收集各組對數(shù)生長期毛囊干細(xì)胞，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒步驟進(jìn)行處理，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞所處周期情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 qPCR法檢測細(xì)胞增殖及分化標(biāo)志物mRNA水平 以β-actin作為內(nèi)參基因，采用qPCR 法檢測各組細(xì)胞中的細(xì)胞增殖標(biāo)志物（KI67、PCNA）、細(xì)胞增殖經(jīng)典通路標(biāo)志物（AKT、mTOR）、細(xì)胞分化標(biāo)志物（K6、S100A3）、細(xì)胞分化經(jīng)典通路標(biāo)志物（Notch1、β-catenin）的mRNA水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

按照Trizol 試劑盒中說明書的步驟提取總RNA，標(biāo)記后進(jìn)行芯片雜交，選取芯片結(jié)果中KI67、PCNA、AKT、mTOR、K6、S100A3、Notch1、β-catenin進(jìn)行熒光定量PCR 分析。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成環(huán)狀DNA，反應(yīng)條件：變性（95 ℃，10 s）→退火（60 ℃，20 s）→延伸（70 ℃，10 s），共計(jì)40 個循環(huán)。引物的設(shè)計(jì)與合成來自生工生物工程（上海）股份有限公司，各基因的引物序列見表1。2-△△Ct法計(jì)算KI67、PCNA、AKT、mTOR、K6、S100A3、Notch1、β-catenin的相對表達(dá)量。

表1 擴(kuò)增基因及引物序列

1.3.5 Western blot檢測細(xì)胞增殖及分化標(biāo)志物蛋白水平 采用RIPA 裂解緩沖液提取細(xì)胞或組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取上樣緩沖液與樣品混合并置于95 ℃變性l0 min。蛋白樣品以每孔50μg加到10%SDS-PAGE中電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上后，5%脫脂奶粉封閉2 h。將抗體（1∶1 000）加入至PVDF膜，β-actin為內(nèi)參。4 ℃過夜。棄一抗，加入1∶1 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。棄二抗。ECL 化學(xué)發(fā)光劑顯色，暗室下顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測各組毛囊干細(xì)胞增殖情況

CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，miR-22-5P mimics 轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，miR-22-5P轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力值明顯低于空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明上調(diào)miR-22-5P對毛囊干細(xì)胞具有增殖抑制作用。見表2。

表2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-22-5P對毛囊干細(xì)胞增殖的影響（±s）

2.2 EdU實(shí)驗(yàn)檢測各組毛囊干細(xì)胞增殖情況

EdU 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，miR-22-5P mimics 轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，miR-22-5P轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖比明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明上調(diào)miR-22-5P 對毛囊干細(xì)胞具有增殖抑制作用。見表3。

表3 EdU實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-22-5P對毛囊干細(xì)胞增殖的影響（±s）

2.3 流式細(xì)胞法檢測各組毛囊干細(xì)胞所處周期分布情況

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各組毛囊干細(xì)胞所處周期分布情況，見表4。miR-22-5P轉(zhuǎn)染后，處于S期的毛囊干細(xì)胞比例較空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；處于G0~G1期的毛囊干細(xì)胞比例較空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組明顯增加（P＜0.05）。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-22-5P 能夠使毛囊干細(xì)胞阻滯于G0~G1期。

表4 流式細(xì)胞法檢測各組毛囊干細(xì)胞所處周期分布情況（±s，%）

2.4 qPCR 法檢測各組增殖相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平

miR-22-5P 轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞后，KI67、PCNA、AKT的mRNA 表達(dá)水平均顯著低于空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組毛囊干細(xì)胞中mTOR的mRNA 表達(dá)量基本相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表5。

表5 qPCR法檢測各組增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平（±s）

2.5 Western blot檢測各組增殖相關(guān)蛋白表達(dá)量

Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測毛囊干細(xì)胞增殖過程中相關(guān)蛋白的表達(dá)量，見圖1。miR-22-5P 轉(zhuǎn)染組KI67、PCNA、AKT 蛋白表達(dá)量明顯低于空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組，表明miR-22-5P 能夠激活A(yù)KT 通路，對毛囊干細(xì)胞的增殖發(fā)揮抑制作用。

A：空白對照組；B：空白轉(zhuǎn)染組；C：miR-22-5P轉(zhuǎn)染組

2.6 qPCR 法檢測各組細(xì)胞分化標(biāo)志物mRNA 表達(dá)水平

如表6 所示，miR-22-5P 轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞后，K6、S100A3、Notch1的mRNA 表達(dá)水平均顯著高于空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組毛囊干細(xì)胞中β-catenin的mRNA 表達(dá)量基本相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表6 qPCR法檢測各組細(xì)胞分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平（±s）

2.7 Western blot檢測各組分化相關(guān)蛋白表達(dá)量

Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測毛囊干細(xì)胞分化過程中相關(guān)蛋白的表達(dá)量，見圖2。miR-22-5P 轉(zhuǎn)染組K6、S100A3、Notch 蛋白表達(dá)量明顯高于空白對照組、空白轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明miR-22-5P 能夠激活Notch 通路，誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞向毛囊分化。

A：空白對照組；B：空白轉(zhuǎn)染組；C：miR-22-5P轉(zhuǎn)染組

3 討 論

有研究通過聯(lián)合分析絨山羊毛囊各個時(shí)期miRNA和mRNA的數(shù)據(jù)，對調(diào)控毛囊周期性生長的關(guān)鍵miRNA 進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-182、miR-151-3p、miR-143-3p 對毛囊干細(xì)胞的增殖分化發(fā)揮重要調(diào)控作用［4-7］。miR-22-5P是近年來發(fā)現(xiàn)的與毛囊干細(xì)胞預(yù)測靶基因之間存在靶向關(guān)系的miRNA，前期有研究對miR-22-5P 的靶向基因進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LEF1、Dlx3、Foxn1、Sostdc1等在毛囊的分化過程中發(fā)揮重要作用［8-9］。且有研究發(fā)現(xiàn)，miR-22-5P 伴隨毛囊的周期變化表達(dá)量明顯改變［10］，以上均說明miR-22-5P 在毛囊周期變化中具有潛在的作用，能夠促進(jìn)毛囊從生長期到退行期的轉(zhuǎn)變。因此本研究選取miR-22-5P作為研究毛囊干細(xì)胞增殖分化調(diào)控機(jī)制的靶點(diǎn)。

本研究通過CCK8 實(shí)驗(yàn)、EdU 實(shí)驗(yàn)分析了miR-22-5P對毛囊干細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果證實(shí)，miR-22-5P mimics轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，說明上調(diào)miR-22-5P 對毛囊干細(xì)胞具有增殖抑制作用。流式細(xì)胞法檢測了miR-22-5P對毛囊干細(xì)胞所處周期分布的影響，數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)染miR-22-5P后，處于S 期的毛囊干細(xì)胞比例較對照組明顯減少（P＜0.05）；處于G0~G1期的毛囊干細(xì)胞比例較對照組明顯增加（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，過表達(dá)miR-22-5P 能夠使毛囊干細(xì)胞阻滯于G0 ~ G1 期。進(jìn)一步證實(shí)了miR-22-5P促進(jìn)毛囊干細(xì)胞細(xì)胞周期停止，阻止細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用。PI3K/AKT/mTOR 信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要通路［11］；而Wnt/β-catenin 和Notch1 通路是促進(jìn)毛囊干細(xì)胞分化過程的經(jīng)典通路［12］。本研究通過分析各組增殖標(biāo)志物（KI67 和PCNA）、增殖相關(guān)通路（AKT/mTOR）在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，證實(shí)了miR-22-5P 能夠激活A(yù)KT 通路，對毛囊干細(xì)胞的增殖發(fā)揮抑制作用。通過分析各組分化標(biāo)志物（K6、S100A3）、分化相關(guān)通路基因（Notch1 和β-catenin）在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)，證實(shí)了miR-22-5P 能夠激活Notch通路，誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞向毛囊分化。

綜上所述，本研究通過多種方法檢測了miR-22-5P 對絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖和分化的影響，發(fā)現(xiàn)miR-22-5P的表達(dá)增加能夠?qū)γ腋杉?xì)胞發(fā)揮增殖抑制作用，且可通過激活相關(guān)信號通路促進(jìn)毛囊干細(xì)胞向毛囊分化。在后續(xù)的研究中，將利用生物學(xué)信息分析手段篩選出影響毛囊干細(xì)胞增殖和分化的其他miRNA和關(guān)鍵基因，進(jìn)一步闡明毛囊干細(xì)胞增殖分化調(diào)控的相關(guān)機(jī)制和調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突