白劍宇，羅 達，劉正興，李 宏

(1.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟林研究所，烏魯木齊 830063；2.新疆林業(yè)科學(xué)院，烏魯木齊 830063；3.阿克蘇地區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，烏魯木齊 834000)

0 引 言

【研究意義】棗樹花葉病毒病病原為山梣環(huán)斑病毒屬(Emaravirus)中的一個新種，暫命名為中國棗樹花葉伴隨病毒(Chinese date mosaic-associated virus，CDMaV)[1]。該病傳播速度快，危害嚴(yán)重，前期隱癥不易發(fā)現(xiàn)，一旦顯癥就已錯過最佳防治時間。常規(guī)的癥狀觀察和病原的電鏡掃描鑒定方法熬時長、程序繁瑣，很難實現(xiàn)對病害發(fā)生動態(tài)的及時監(jiān)測和有效控制病害的傳播和流行。建立棗樹花葉病毒病的快速、準(zhǔn)確的分子檢測技術(shù)，對于探索病害防控的關(guān)鍵點以及制定適時有效的防治措施提供重要的理論依據(jù)和指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M展】2016年9月，棗樹花葉病毒病在新疆紅棗主產(chǎn)區(qū)阿克蘇地區(qū)發(fā)生。該病害主要危害棗樹葉片和果實，造成葉片斑駁、卷曲，樹勢明顯減弱，受害果實初期在果面上出現(xiàn)水浸狀褪綠斑，隨后病斑凹陷，果實畸形，后期逐漸萎縮脫落，造成整株產(chǎn)量損失在30%以上。依據(jù)病害癥狀特點，初步判斷該病害為植物病毒侵染所致。病害葉片樣本經(jīng)小RNA深度測序分析[1-2]，分析預(yù)測結(jié)果指向病毒。以小RNA測序分析結(jié)果為指向，采用分段設(shè)計特異性引物，通過RT-PCR技術(shù)對缺失部分的基因序列擴增并測序，采用RACE法分別擴增各條RNA片段的5，末端和3，末端序列，利用生物信息學(xué)軟件組裝出病毒的全基因組序列，并通過生物學(xué)信息的比對分析將病毒鑒定為山梣環(huán)斑病毒屬(Emaravirus)中的一個新種，暫命名為中國棗樹花葉伴隨病毒[3]，通過對危害棗樹的棗癭螨進行病毒檢測，同樣在棗癭螨體內(nèi)檢測到了CDMaV的存在，符合該屬病毒由癭螨科傳播的特征[4-7]。2015年白劍宇等[8-10]報道了由Alternariaalternata和Notherphomaquercina侵染棗樹的3種新病害以來，再次發(fā)現(xiàn)的一種由病毒侵染引起的棗樹新病害。【本研究切入點】研究在獲得基因組全序列的基礎(chǔ)上，以病毒基因組RNA5基因序列為靶標(biāo)，利用primer5.0 軟件設(shè)計靈敏度極高的特異性引物，通過PCR反應(yīng)體系優(yōu)化后的引物特異性擴增與靈敏度的檢測，建立棗樹花葉病的分子檢測技術(shù)，并利用該技術(shù)在紅棗整個生育期進行病害侵染動態(tài)的追蹤檢測與分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】追蹤檢測病害田間侵染動態(tài)，研究棗樹花葉病毒病田間侵染動態(tài)，分析病害防治的關(guān)鍵時間節(jié)點，為新疆棗樹花葉病毒病的流行監(jiān)測和早期防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棗樹花葉病毒病樣本

棗樹花葉病毒病陽性對照樣本為實驗室收集于阿克蘇和喀什兩個地州的棗樹花葉病毒病葉片，提取總RNA后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，并保存于-80℃低溫冰箱的葉片cDNA樣本。引物特異性驗證材料由新疆林科院有害生物實驗室收集于新疆不同地區(qū)不同作物病毒病的葉片樣本，提取總RNA后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，并保存于-80℃低溫冰箱的葉片cDNA樣本，包括棗瘋病、蘋果花葉病、無花果病毒病、丁香病毒病、苜蓿病毒病、番茄黃化曲葉病毒病和西甜瓜病毒病等7種作物病毒病cDNA陽性樣本。追蹤檢測材料是在棗樹整個生育期內(nèi)的不同時間點自不同監(jiān)測點采集到的疑似棗樹花葉病毒病葉片樣本(300份)。

供試引物：依據(jù)CDMaV基因組RNA5序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計的一對特異性引物JUP5-F(5’-CAAGCATAGCAATTGATGAC-3’)和JUP5-R(5’-ACTTGATCTATGGACTGAAC-3’)，預(yù)計產(chǎn)物片段大小為432 bp，作為RT-PCR的檢測內(nèi)參，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要試劑和儀器

BIO-RAD T100 PCR，美國伯樂中國上海分公司；DYY6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；KCBIO2008凝膠成像系統(tǒng)，北京原平皓生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以及2×PCR反應(yīng)液等試劑購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 葉片樣本RNA提取與RT-PCR

按照Trizol RNA提取試劑操作說明分別提取300份采自不同監(jiān)測點的棗樹花葉病毒病葉片樣本的總RNA。采用美國Bio-Rad公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對上述各樣本總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣本放于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫崔D(zhuǎn)錄合成體系及反應(yīng)條件如下：取-70℃保存的棗樹新病毒病葉片總DNA陽性樣本作為陽性對照，以滅菌的雙蒸水為陰性對照，以棗瘋病、蘋果花葉病毒、無花果病毒、西甜瓜病毒、苜蓿花葉病毒、番茄黃化曲葉病毒、丁香環(huán)斑病毒等7種作物的葉片總DNA做為特異性檢測的對照。反轉(zhuǎn)錄合成體系為：5倍的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液4 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，RNA模板 5 μL，無RNA酶的dd H2O補足至20 μL。反轉(zhuǎn)錄合成條件：25℃，5 min；85℃，5 min，42℃，30 min，4℃保存。

1.2.2 引物的特異性檢測

取-80保存的棗樹花葉病毒病葉片總cDNA陽性樣本作為陽性對照，以滅菌后的雙蒸水為陰性對照，以棗瘋病、蘋果花葉病毒、無花果病毒、西甜瓜病毒、苜?；ㄈ~病毒、番茄黃化曲葉病毒、丁香環(huán)斑病毒等7種作物的葉片總cDNA作特異性檢測的陰性對照，利用引物(JUP5-F)/(JUP5-R)對來源于不同作物病毒病葉片的cDNA樣本進行PCR的特異性檢測。PCR 反應(yīng)體系(20 μL)：10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2×PCR反應(yīng)液10 μL，模板 cDNA 2 μL，dd H2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃，10 min；94℃，1 min，56℃，45 s，72℃，2 min，35 個循環(huán)；72℃延伸 10 min。

1.2.3 引物的靈敏性檢測

將-80℃保存的棗樹花葉病毒病葉片總cDNA陽性樣本用紫外分光光度計測定濃度后，取陽性cDNA樣本10 μL，按10倍梯度稀釋(107、106、105、104、103、102、10、1)8個不同濃度，采用已建立的RT-PCR技術(shù)體系進行擴增，檢測引物(JUP5-F)/(JUP5-R)的靈敏度。

1.2.4 棗樹花葉病毒病田間發(fā)生動態(tài)追蹤監(jiān)測

依據(jù)棗樹花葉病毒病在新疆南疆地州的發(fā)生與分布情況，選取棗樹花葉病毒病發(fā)生較重的地塊作為病害田間發(fā)生動態(tài)追蹤檢測的對象，包括阿克蘇市依桿旗鄉(xiāng)、巴楚縣阿拉格爾鄉(xiāng)和岳普湖縣巴依阿瓦提鄉(xiāng)紅棗種植園，總面積約26.67 hm2(400畝)。棗樹品種均為灰棗，樹齡分別為7年、8年和10年。自2019年5月初棗樹展葉期至8月中、下旬棗樹花葉病毒病葉片顯癥高峰期，采用5點取樣法分別于5、6、7和8月采集疑似棗樹花葉病毒病葉片樣本，每個棗園每個時間點各取25份，提取各樣品總RNA，利用已建立的RT-PCR 技術(shù)進行帶毒率的分子檢測和病害田間侵染動態(tài)分析。表1

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的特異性檢測

研究表明，檢測引物(JUP5-F)/(JUP5-R)對供試棗樹花葉病毒病葉片樣本總cDNA均能穩(wěn)定地擴增出432 bp單一的目的條帶，而其它不同作物的cDNA樣本和陰性對照均未擴增出明亮的目的條帶，擴增穩(wěn)定性好，特異性強。圖1

注：M：100 bp Marker；1～3：棗樹花葉病毒；4～5：棗瘋??；6～7：蘋果花葉病毒；8～9：無花果病毒；10～11：西甜瓜病毒；12～13：苜?；ㄈ~病毒；14～15：番茄黃化曲葉病毒；16～17：丁香環(huán)斑病毒；CK：陰性對照

2.2 引物的靈敏性檢測

研究表明，棗樹花葉病毒病葉片陽性樣本總cDNA的分光光度計測定濃度為0.479 ng/μL，將初始cDNA梯度稀釋至105倍液(4.79 pg/μL)時，仍能檢測到目的條帶，說明(JUP5-F)/(JUP5-R)引物在優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系條件下，對棗樹花葉病毒病具有較高的檢測靈敏度，可用于棗樹花葉病毒病病原的田間侵染動態(tài)的追蹤檢測與驗證。圖2

注：M：DNA Marker；1～8：cDNA 依次稀釋梯度為1～107倍液；CK：陰性對照

2.3 棗樹花葉病毒病田間侵染動態(tài)的追蹤檢測

研究表明，3個棗園不同時期采集的疑似棗樹花葉病毒病葉片樣本均可檢測到棗樹花葉病毒的存在，且隨著月份的增加，病原檢出率呈逐漸升高的趨勢。其中5月采集的棗樹葉片樣本的病菌檢出率相對較低，最高檢出率為28%，最低檢出率為20%，而在6月采集的葉片樣本中病害檢出率明顯升高5月的病害檢出率，7～8月達到高峰，檢出率在80%以上，最高達100%。表1

表1 樣品材料及棗樹花葉病毒病田間發(fā)生動態(tài)的檢測結(jié)果

3 討 論

棗樹花葉病毒病是2016年研究團隊在新疆阿克蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種國際新病害。杜凱桐等[11]在北京地區(qū)表現(xiàn)花葉病的棗樹上發(fā)現(xiàn)并報道了1種引起棗樹花葉的DNA病毒(JuMaV), 并對其基因組進行了測序分析，獲取了該病毒的全基因組序列，該病毒侵染棗樹，僅造成侵染葉片黃化畸形，而針對新疆阿克蘇地區(qū)棗樹上表現(xiàn)花葉癥狀的葉片和畸形的果實樣品進行測序分析，分離鑒定到一種負鏈RNA病毒，該病毒為山梣環(huán)斑病毒屬(Emaravirus)中的一個新成員[12]。目前，該病毒僅在中國發(fā)生，針對該棗樹花葉病病原及侵染循環(huán)規(guī)律的研究尚處于初始階段，該病毒是否是棗樹病毒病的主要病原，還需要后續(xù)的試驗驗證。依據(jù)前期調(diào)查與研究結(jié)果，該病害不僅葉片表現(xiàn)黃花卷曲，還危害果實，造成果實畸形，提早脫落。該病一般在每年的7月初首先在當(dāng)年生棗頭枝上的幼嫩葉片顯癥，前期沒有明顯的發(fā)病癥狀，果農(nóng)通常忽略前期對棗樹病毒病的防治，僅在葉片或棗果顯癥期進行防治，致使防治效果很難達到預(yù)期的目標(biāo)。利用分子檢測技術(shù)開展棗樹病毒病的早期診斷與監(jiān)測，探索病害防治的關(guān)鍵時間節(jié)點顯得尤為重要。因此，在小RAN深度測序分析的基礎(chǔ)上，獲得了棗樹病毒病病原的全基因組序列，并以基因組RNA5序列設(shè)計出一對高特異性引物，建立了針對棗樹花葉病毒病RT-PCR分子檢測技術(shù)，檢測靈敏度達到4.79 pg/μL，引物(JUP5-F)/(JUP5-R)特異性強而且靈敏度高，具有實際可操作性，可用于棗樹花葉病毒病田間侵染動態(tài)的追蹤檢測。

在棗樹花葉病毒病田間追蹤檢測研究中，發(fā)現(xiàn)3個棗園不同時期采集的疑似棗樹花葉病毒病病害樣本病原檢出率隨著月份的增加呈逐漸升高的趨勢。眾所周知，作物病毒病是一個系統(tǒng)侵染病害，但棗樹花葉病毒病的潛伏期長，癥狀一旦出現(xiàn)便已錯過了病害防治的關(guān)鍵時間節(jié)點。

4 結(jié) 論

在前期獲得棗樹花葉病毒病病原的全基因組序列的基礎(chǔ)上，以基因組RNA5序列設(shè)計出一對高特異性引物(JUP5-F)/(JUP5-R)，通過反應(yīng)體系的優(yōu)化組合建立了棗樹花葉病毒病的RT-PCR分子檢測技術(shù)，檢測靈敏度達到4.79 pg/μL。該引物對特異性強而且靈敏度高，具有實際可操作性，可作為棗樹花葉病毒病田間侵染動態(tài)的追蹤檢測。

棗樹葉片帶毒率隨著月份的增加而增加，最佳防控時間節(jié)點在5月中下旬。其中5～6月檢出率較低，7～8月的檢出率明顯高于5～6月，這與病害前期隱癥，7月葉片顯癥，8月進入顯癥高峰期的田間調(diào)查結(jié)果相一致。