朱曉鋒，蔡淑琳，蘇卓文，張殿朋，宋 博，徐兵強，阿布都克尤木·卡德爾，楊 森

(1.農業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/特色林果產業(yè)國家地方聯合工程研究中心/新疆農業(yè)科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2.北京市農林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097)

0 引 言

【研究意義】小蠹蟲與真菌伴生(共生)是長期協同進化的結果，二者所形成的關系是眾多共生體系中的典型代表之一[1]。在植物-小蠹蟲-伴生菌系統(tǒng)中，小蠹蟲與伴生菌形成了依賴性和穩(wěn)定性的關系：一方面小蠹蟲作為媒介傳播、擴散伴生菌，實現伴生菌在寄主樹體內入侵和繁殖；另一方面小蠹蟲依賴伴生菌克服寄主樹木抗性，實現小蠹蟲在寄主樹木上有效定殖。伴生菌可導致寄主樹木韌皮部中脂類物質的增加，改變韌皮部中樹脂含量和愈傷組織的產生，決定小蠹蟲能否成功定殖；伴生菌在削弱寄主樹木抗性、協助小蠹蟲侵害寄主方面起著重要作用[2, 3]。研究小蠹蟲與其伴生菌的相互關系已成為系統(tǒng)研究小蠹蟲綜合控制策略與技術的重要組成部分[4, 5]。臍腹小蠹ScolytusschevyrewiSemenov(又名多毛小蠹ScolytusseulensisMurayama)記錄于新疆天山東部[6]。臍腹小蠹是新疆果樹特別是杏ArmeniacavulgarisLam.、西梅PrunusdomesticaL.、桃AmygdaluspersicaL.和扁桃(巴旦木)AmygdaluscommunisL.等薔薇科果樹的重大害蟲，常造成果樹枝、株的大量死亡[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c】近年來在新疆臍腹小蠹仍然普遍為害，并未有減輕的趨勢。亟需研究新疆南部地區(qū)果園臍腹小蠹伴生真菌種類，分析其功能?！緮M解決的關鍵性問題】在新疆疏勒、英吉沙等地采集被害果樹上的臍腹小蠹成蟲，利用MiSeq高通量測序技術和室內分離培養(yǎng)的方法，鑒定其伴生真菌種類或類群，研究新疆果樹臍腹小蠹是否攜帶、傳播植物病原性真菌，為新疆果樹臍腹小蠹的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

在新疆南部地區(qū)疏勒、疏附、英吉沙、阿克陶縣的杏、桃、扁桃、西梅等果園，每個果園隨機選擇3個采樣點，每采樣點隨機選擇被臍腹小蠹為害的枝干(長40～50 cm，直徑7～10 cm)1～2枝，帶回實驗室。在實驗室內(25 ± 2)℃飼養(yǎng)，直至成蟲羽化。表1

表1 樣品采集地信息

體表伴生真菌樣品制備：實驗室內，取從不同果樹枝干羽化的健康成蟲5 頭，分別放入含有5 mL滅菌水的無菌試管中，蓋緊瓶蓋后，放在振蕩器上劇烈震蕩5～10 min，靜置后取上清液3 mL備用，重復3次。

腸道伴生真菌樣品制備：取從不同果樹枝干羽化的健康成蟲5頭，分別放入75%的酒精中滅菌1 min，再用蒸餾水沖洗 3 次。立即在無菌條件下解剖，取出腸道，放在含有5 mL的滅菌水的無菌試管中，蓋緊瓶蓋后，放在振蕩器上劇烈震蕩5～10 min，靜置后取上清液3 mL備用，重復3次。

1.2 方 法

1.2.1 樣品總DNA提取和PCR擴增

采用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)對4種果樹臍腹小蠹體表與腸道伴生真菌樣品的 DNA進行提取，并重復3次。利用 NanoDrop2000進行檢測DNA 濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用真菌引物ITS1 F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和 ITS2 R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)；對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預變性3 min，循環(huán)數(35個)×(95℃變性30s，55℃退火30s, 72℃延伸45s)，最后72℃延伸10 min(PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型)。再用 2%瓊脂糖凝膠回收 PCR 產物，利用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進行檢測定量。根據 Illumina MiSeq 平臺(Illumina,San Diego,USA)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建 PE 2×300 的文庫。

構建文庫步驟:(1)連接“Y”字形接頭；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用 PCR擴增進行文庫模板的富集；(4)氫氧化鈉變性, 產生單鏈 DNA 片段。最后用 Illumina 公司的 Miseq PE300 平臺進行測序。

1.2.2 室內伴生真菌的分離與鑒定

1.2.2.1 培養(yǎng)基制備

試驗所需各種培養(yǎng)基如下：酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、牛肉膏培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.2.2.2 伴生真菌的分離與純化

在超凈工作臺上，分別取50 μL 體表和腸道伴生真菌樣品均勻涂布在各種培養(yǎng)基上，并重復 3 次。體表伴生真菌分離平板直接放在室溫25 ℃條件下，腸道伴生真菌分離平板放入密封培養(yǎng)盒中(盒內分別放入微需氧產氣袋和厭氧產氣袋)再放在室溫條件下，培養(yǎng)48～72 h，待有菌落長出后，挑取單菌落純化培養(yǎng)。并參考《真菌鑒定手冊》等進行伴生真菌形態(tài)特征鑒定[10]。

1.2.2.3 分子生物學鑒定

將分離純化的伴生真菌，通過菌落特征，初步分類后，對5.8S rRNA序列進行擴增。引物采用ITS1 : 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4 : 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；基因組提取用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN，T50)試劑盒按照說明進行提取；PCR儀器為BIO-Rad(MyCycler)，PCR 程序如下所述：

序列擴增PCR反應體系：基因組模板2.0 μL、10 × PCR buffer(mg2+free)2.5 μL、dNTP(2.5 mM each)1.0 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、EXTaq(2.5 u/μL)0.5 μL、ddH2O 18.0 μL，共25 μL。

反應條件：94℃預變性10 min；然后 94℃保持60 s，55℃保持45 s，72℃保持60 s，35個循環(huán)；72℃保持10 min，1個循環(huán)；4℃保溫。

PCR產物純化及測序：將PCR產物放在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳緩沖液為1 × TAE。電泳結束后將凝膠于10 μg/μL溴化乙淀中染色15～20 min，于Alpha凝膠成像儀中觀察并記錄結果，然后將反應體系送至北京天一輝遠公司進行測序。將獲得的菌株序列在NCBI網址https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行BLAST(Basic Local Alignmentsearch Tool)比對，結合病原菌的形態(tài)學特征，對病原菌進行鑒定分類。

1.3 數據處理

原始測序序列使用 Trimmomatic 軟件質控，使用 FLASH 軟件進行拼接：(1)設置 50 bp 的窗口，如果窗口內的平均質量值低于 20，從窗口開始截去后端堿基，去除質控后長度低于 50 bp 的序列；(2)barcode 需精確匹配，引物允許 2 個堿基的錯配，去除模糊堿基；(3)根據重疊堿基 overlap 將兩端序列進行拼接，overlap 需大于 10 bp。去除無法拼接的序列。使用的 UPARSE 軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據 97%的相似度對序列進行 OTU 聚類；使用 UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用 RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋，比對 Silva 數據庫(SSU123)，設置比對閾值為 70%。基于 OTU 計算稀釋曲線、群落豐富度指數(Chao1、ACE)和群落多樣性指數(Shannon、Simpson)等。高通量測序結果采用 FUNGuild v1.0 軟件分析真菌功能分類。將獲得 OTU 上傳到 FUNGuild 分析平臺(http://www.funguild.org/)進行分析；下載運行結果后對結果進行篩選。

2 結果與分析

2.1 伴生真菌多樣性

研究表明，臍腹小蠹腸道真菌的OTU數量、ACE指數、Chao指數、Shannon指數均高于體表，各項指數均未達顯著性差異(P<0.05)，果樹臍腹小蠹腸道伴生菌多樣性略高于體表，但未達到顯著性差異。表2

表2 臍腹小蠹伴生菌Alpha多樣性指數

2.2 伴生真菌群落組成

研究表明，臍腹小蠹體表、腸道伴生真菌主要由7個門、24個綱、66個目、124個科的221個屬組成；其中腸道優(yōu)勢菌群為Geosmithia、Pleosporales和Gibellulopsis，在群落組成中的占比分別為42.14%、15.61%和6.97%；體表優(yōu)勢菌群為Geosmithia、Saccharomycetales、Byssochlamys和Wickerhamomyces占比分別為29.55%、19.50%、8.20%和6.07%。表3，圖1

表3 臍腹小蠹體伴生真菌群落組成

注：a腸道，b體表

2.3 伴生真菌FUNGuild 功能預測

研究表明，臍腹小蠹伴生真菌營養(yǎng)型組成較為相似，以腐生營養(yǎng)型(saprotroph)、植物致病型(plant pathogen)、病理-腐生營養(yǎng)型(pathotroph-saprotroph)和動物致病型(animal pathogen)為主；在伴生菌群落中，腐生營養(yǎng)型和病理-腐生營養(yǎng)型的真菌比例較高，其中未定義的腐生真菌比例最高，在體表和腸道中分別占71.57%和50.46%；其次是功能未知的真菌，在體表中占8.60%，在腸道中占21.35%；而體表攜帶植物致病真菌的比例為6.25%，腸道為9.92%；動物致病真菌在體表和腸道中的比例分別為0.31%和0.65%(圖2a)；在為害不同果樹的臍腹小蠹伴生菌中，仍以腐生營養(yǎng)型和病理-腐生營養(yǎng)型的真菌為主，其中未定義的腐生真菌占比較高，在為害西梅樹、杏樹、桃樹和扁桃樹的臍腹小蠹攜帶比例依次降低，分別為71.86%、65.95%、54.85%和42.86%；此外，為害4種果樹的臍腹小蠹均攜帶植物致病真菌，其中為害桃樹的臍腹小蠹攜帶植物致病真菌比例最高，為19.06%，其次是為害杏樹的臍腹小蠹，占9.46%，再次是扁桃和西梅，分別為3.25%和1.58%；而為害桃樹、杏樹和西梅的臍腹小蠹攜帶有動物致病真菌，分別占1.28%、0.56%和0.10%(圖2b)。圖2

注：CD：腸道，TB：體表，B：扁桃樹，M：西梅樹，T：桃樹，X：杏樹

2.4 室內伴生真菌的分離與鑒定

研究表明，為臍腹小蠹伴生真菌分別為10個屬的13種真菌，分別為新疆假絲酵母(Candidaxinjiangensis)、Candidapeoriensis、漢姆酵母(Wickerhamomycessilvicola)、威克漢姆西弗酵母(Wickerhamomycesciferrii)、季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、Yamadazymamexicana、Naganishiaalbida、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)、Geosmithiapallida和大孢枝孢菌(Cladosporiummacrocarpum)，以及假絲酵母1種(疑似新種)(Candidasp.)和擬青霉1種(Paecilomycessp.)；臍腹小蠹體表伴生真菌有12種，腸道伴生真菌有8種。表3

2.5 室內鑒定的伴生真菌功能

研究表明，在已鑒定臍腹小蠹伴生真菌中，7種伴生真菌有相關功能報道，根據已報道相關功能，可分為2類，一類為植物致病真菌，有Y.mexicana、G.pallida和大孢枝孢菌；另一類為有益菌，對多種植物病原菌有殺菌、抑制或拮抗作用，有漢姆酵母、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母和出芽短梗霉菌；而C.xinjiangensis、C.peoriensis、威克漢姆西弗酵母和N.albida4種真菌無相關功能的報道。表4

表4 臍腹小蠹伴生真菌的分離與鑒定

3 討 論

昆蟲共生菌主要有以下幾方面的功能：一是營養(yǎng)和物質代謝功能；二是影響昆蟲的生長發(fā)育；三是影響昆蟲行為；四是保護昆蟲的作用[43]。通過對杏、扁桃、桃、西梅等果樹臍腹小蠹伴生真菌的高通量測序和FUNGuild功能預測可以看出臍腹小蠹伴生有大量的真菌，且營養(yǎng)型豐富，含有腐生營養(yǎng)型真菌、植物致病型真菌、病理-腐生營養(yǎng)型真菌和動物致病型真菌；此外通過室內培養(yǎng)鑒定和功能分析伴生真菌中既有植物致病真菌又有對植物病原菌有殺菌、抑制或拮抗作用的生防有益菌，與FUNGuild功能預測結果具有一定的一致性。臍腹小蠹伴生菌是一個微生態(tài)系統(tǒng)，作者認為這些伴生菌在臍腹小蠹寄主定殖過程中起著重要的協同作用。如植物致病真菌(如G.pallida、Y.mexicana和大孢枝孢菌等)被臍腹小蠹普遍攜帶并傳播，為臍腹小蠹為害和克服寄主抗性提供有利條件。而一些有益菌(如W.silvicola、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母、出芽短梗霉菌對臍腹小蠹的為害起抑制作用。

酵母菌也是小蠹蟲常見的伴生菌，大多數小蠹蟲個體僅伴生一種或少量幾種，并且存在于小蠹蟲的所有生命階段，也存在于卵室、蛹室、幼蟲和成蟲消化道以及寄主韌皮部和木質部組織中；伴生酵母菌產生的揮發(fā)性化學物質具有廣泛的生物活性，低濃度下可吸引小蠹蟲，高濃度有驅避作用，其揮發(fā)物也可以作為捕食性和寄生性天敵搜尋小蠹蟲的重要物質；伴生酵母菌還可以改變樹體組織的化學成分或代謝有毒的萜類化合物，因此，伴生酵母菌對小蠹蟲可能具有調節(jié)種間競爭、產生信息素、分解植物有毒物質、提供營養(yǎng)補充的作用[44，45]。如伴生酵母菌Ogataeapini產生的揮發(fā)物可顯著促進西松大小蠹Dendroctonusbrevicomis互惠共生菌Entomocorticiumsp.B的生長，抑制其病原菌Beauvariabassiana的生長，并能參與到寄主植物組織中對萜類揮發(fā)物的反應之中，改變韌皮部組織的化學環(huán)境，產生乙醇，二硫化碳(CS2)和Δ-3-蒈烯(對小蠹蟲具有引誘作用)[45，46]。在研究中在新疆果樹臍腹小蠹伴生菌多種酵母菌，如新疆假絲酵母、漢姆酵母、威克漢姆西弗酵母、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母、Y.mexicana和C.peoriensis。其中，Y.mexicana為植物致病真菌，而漢姆酵母、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母為多種致病菌的拮抗菌或生防菌，此外，新疆假絲酵母、C.peoriensis和威克漢姆西弗酵母其生態(tài)學功能未見報道，其中新疆假絲酵母為新疆果樹臍腹小蠹伴生真菌報道之新種。進一步研究臍腹小蠹伴生酵母等真菌的生物、生態(tài)學功能，對進步一揭示臍腹小蠹的發(fā)生為害和綜合治理具有重要意義。

表5 已鑒定果樹臍腹小蠹伴生真菌功能分析

4 結 論

新疆南部地區(qū)果園臍腹小蠹伴生真菌落是一個微生態(tài)系統(tǒng)，主要有腐生營養(yǎng)型、植物致病型、病理-腐生營養(yǎng)型和動物致病型真菌組成，且不同果園臍腹小蠹均攜帶植物致病真菌，其中為害桃樹的臍腹小蠹攜帶比例最高，為19.06%；室內鑒定出植物致病真菌3種、有益拮抗真菌4種。新疆果樹臍腹小蠹普遍攜帶、傳播植物病原菌，在防控臍腹小蠹的同時應注重果樹枝干病害的防控；而伴生真菌中的有益拮抗菌可作為生物防治菌被開發(fā)利用。