楊 璐，范少麗，李 宏，程 平，張志剛

(新疆林業(yè)科學(xué)院測(cè)試中心/新疆林木資源與利用國(guó)家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆林果樹(shù)種選育與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054)

0 引 言

【研究意義】桑葚(FructusMori)是桑科桑屬多年生木本植物[1,2]。桑葚抗氧化能力顯著[3,4]，利用桑葚果實(shí)發(fā)酵制酒，并將其工業(yè)化生產(chǎn)提供具有一定意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)桑葚酒研究多集中于發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，以及加工過(guò)程中理化性質(zhì)、風(fēng)味物質(zhì)、感官指標(biāo)等變化[5-7]。葉學(xué)林等人[5]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚果酒發(fā)酵工藝時(shí)，以白砂糖、檸檬酸和檸檬酸鈉調(diào)整果汁的起始糖度和起始pH值。楊芳等[6]通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚果酒發(fā)酵工藝得到最佳條件為：發(fā)酵溫度為 15.3 ℃，接種量為 8.00 g/L，蔗糖加入量為 12.80 g/100 g?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】現(xiàn)有桑葚果酒研究多以桑葚果汁為發(fā)酵原料，并且大部分會(huì)在發(fā)酵原料中添加蔗糖[5-7]，鮮見(jiàn)未添加外源糖份的桑葚果酒.。研究采用的釀酒原料為新疆本地品種仟格麗桑葚，無(wú)需添加外源糖分?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在桑葚果漿主發(fā)酵12 d后濾去酒腳，再次發(fā)酵，利用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化桑葚果漿主發(fā)酵工藝流程，同時(shí)從香氣、理化指標(biāo)、感官評(píng)價(jià)對(duì)桑葚果酒品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為高品質(zhì)桑葚果酒的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 桑葚

選取新鮮成熟的新疆吐魯番本地品種仟格麗桑葚果(紫黑桑果)作為釀酒原料，可溶性固形物平均含量達(dá) 29.0°Brix。偏重亞硫酸鉀、皂土、降酸酵母、果酒專用酵母、耐低溫酵母LABA均購(gòu)自帝伯仕自釀機(jī)有限公司。

選用27份桑葚果漿，每組果漿7 kg，分別置于10 L玻璃發(fā)酵罐中，再分別接種活化后的不同酵母品種、不同酵母濃度，設(shè)定不同溫度，將不加酵母的桑葚果發(fā)酵試驗(yàn)作為對(duì)照試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。在主發(fā)酵12 d時(shí)測(cè)定各組酒樣理化指標(biāo)。

1.1.2 主要儀器

紫外分光光度計(jì)：日本島津；

WZS-I 型測(cè)糖儀：上海光學(xué)儀器廠；

分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方 法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

(1)將仟格麗桑果清洗干凈；剔除壞果，低溫壓碎。稱取7 kg桑葚果于10 L玻璃廣口發(fā)酵罐中，按壓破碎，破碎過(guò)程中滴加92.5 mg/kg偏重亞硫酸鉀溶液(SO2濃度相當(dāng)于50 mg/kg)用于護(hù)色和滅菌，偏重亞硫酸鉀加入前溶解于10倍無(wú)菌水。加入果膠酶20 mg/kg，常溫(20～30℃)酶解8 h。

(2)酵母活化：先將實(shí)驗(yàn)設(shè)定添加量的活性干酵母加入10倍體積的5%、(35±1)℃糖液中，置于(35±1)℃恒溫水浴鍋中，輕輕攪拌，待酵母活化 15 min，出現(xiàn)一層細(xì)膩的泡沫，即為活化成功。

(3)主發(fā)酵：將活化成功的酵母液加入到待發(fā)酵果漿中，于實(shí)驗(yàn)設(shè)定溫度下發(fā)酵12 d。

(4)過(guò)濾：濾除果渣，將酒液轉(zhuǎn)移至裝有單項(xiàng)排氣閥的發(fā)酵罐中，繼續(xù)發(fā)酵，觀察單向閥氣泡產(chǎn)生很緩慢或無(wú)氣泡出現(xiàn)，將果酒溫度調(diào)整到 4℃，并加入50 mg/kg的SO2，及時(shí)終止發(fā)酵。

(5)陳釀：將發(fā)酵結(jié)束的果酒倒罐分離酒腳，5℃以下滿罐陳釀，防止酒的氧化。視酒腳沉淀狀況倒罐1～2次。

(6)澄清過(guò)濾：原酒陳釀后加入澄清劑，靜置48 h以上。

(7)除菌灌裝：經(jīng)0.22 μm過(guò)濾機(jī)過(guò)濾除菌，過(guò)濾前加入92.5 mg/kg偏重亞硫酸鉀溶液(SO2濃度相當(dāng)于50 mg/kg)，偏重亞硫酸鉀加入前溶解于10倍無(wú)菌水。除菌后用灌裝機(jī)灌裝即得成品。

(8)發(fā)酵過(guò)程中所有容器均需殺菌消毒，使用0.2%SO2溶液沖洗晾干。

1.2.3 桑葚果酒主發(fā)酵單因素試驗(yàn)

(1)不同酵母品種對(duì)發(fā)酵速度的影響

取桑葚果漿7 kg置于10 L玻璃發(fā)酵罐中，桑葚果漿分別接種降酸酵母、果酒專用酵母、耐低溫酵母LABA，酵母濃度為0.2 g/kg，設(shè)定發(fā)酵溫度為20～22℃，啟動(dòng)發(fā)酵。將不加酵母的桑葚果發(fā)酵試驗(yàn)作為對(duì)照試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù) 3 次。在主發(fā)酵進(jìn)行12 d時(shí)測(cè)定各組酒樣理化指標(biāo)。

(2)不同酵母濃度對(duì)發(fā)酵速度的影響

取桑葚果漿7 kg置于10 L玻璃發(fā)酵罐中，桑葚果漿接種耐低溫酵母LABA，分別添加0.1、0.2、0.3g/kg 酵母量，設(shè)定發(fā)酵溫度為20～22 ℃，啟動(dòng)發(fā)酵。將不加酵母的桑葚果發(fā)酵試驗(yàn)作為對(duì)照試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù) 3 次。在主發(fā)酵進(jìn)行12 d時(shí)測(cè)定各組酒樣理化指標(biāo)。

(3)不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵速度的影響

取桑葚果漿7 kg置于10 L玻璃發(fā)酵罐中，桑葚果漿接種 0.2 g/L耐低溫酵母LABA，分別設(shè)定發(fā)酵環(huán)境溫度為16～18℃、20～22℃、24～26 ℃，啟動(dòng)發(fā)酵。將不加酵母的桑葚果發(fā)酵試驗(yàn)作為對(duì)照試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù) 3 次。在主發(fā)酵進(jìn)行12 d時(shí)測(cè)定各組酒樣理化指標(biāo)。

1.2.4 桑葚果酒主發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇發(fā)酵溫度、SO2添加量、酵母濃度這3個(gè)因素為自變量，以桑葚酒的酒精體積分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的 Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法 進(jìn)行優(yōu)化，確定桑葚果酒最佳發(fā)酵工藝條件參數(shù)。見(jiàn)表1。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。表1

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表及編碼

1.2.5 桑葚果酒品質(zhì)評(píng)價(jià)

1.2.5.1 理化指標(biāo)

殘?zhí)橇浚河檬殖痔嵌扔?jì)測(cè)定。pH：酸度計(jì)測(cè)定。酒精度：采用酒精計(jì)法?？偺牵狠焱蛩岱╗10]?？傻味ㄋ幔篏B/T 12456-2008的測(cè)定方法，結(jié)果以酒石酸表示[11]?？偡樱篎olin-酚試劑法[12]。總黃酮：硝酸鋁法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)量黃酮含量[13]?；ㄉ眨簆H示差法[14]。色差：色差儀測(cè)定[15]。

1.2.5.2 香氣成分

萃取方法：在常溫下，準(zhǔn)確稱取5 mL桑葚果酒于20 mL固相微萃取瓶，向瓶中放入磁子，蓋緊樣品瓶蓋，將固相微萃取器的萃取頭插入到樣品瓶中，推出纖維頭(未接觸溶液及瓶壁)。于80℃下平衡10 min，萃取40 min，吸附后將萃取頭直接插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度250℃，解析時(shí)間5 min，開(kāi)啟儀器并采集數(shù)據(jù)。

色譜條件：色譜柱毛細(xì)柱HP 5-MS(30 m × 0.25 mm×0.25 μm)，載氣：He(99.999%)，流速 1.00 mL/min；進(jìn)樣方式：無(wú)分流手動(dòng)進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250℃。表2

表2 色譜條件：升溫程序

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70eV，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，傳輸線溫度250℃。掃描質(zhì)荷比范圍(m/z)30～550。

1.2.5.3 感官

以魯榕榕[16]等感觀分析的方法基礎(chǔ)上，略做改動(dòng)，對(duì)通過(guò)最優(yōu)主發(fā)酵工藝得到的桑葚果酒進(jìn)行了感官分析，對(duì)樣品澄清度、色澤、香氣(濃郁度、豐富感、果香、異味)、滋味(酸度、濃郁度、余味長(zhǎng)短、協(xié)調(diào)感)9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，使用5 分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來(lái)量化，0～4表示感覺(jué)強(qiáng)烈程度逐漸增大。

1.3 數(shù)據(jù)處理

譜圖檢索及成分鑒定由SPME-GC/MS操作得到各樣品的質(zhì)譜相對(duì)豐度圖及總離子流(total ion current，TIC)圖。對(duì) TIC 圖中各有效峰代表的化學(xué)信息，標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù) NIST 11.0，對(duì)比經(jīng)典氣相色譜化合物保留時(shí)間數(shù)據(jù)，鑒定桑葚果酒揮發(fā)物組分中的化學(xué)成分，并用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物在總揮發(fā)性組分中的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母品種對(duì)桑葚果酒主發(fā)酵的影響

研究表明，在桑葚果漿主發(fā)酵進(jìn)行12 d后，耐低溫酵母LABA發(fā)酵的酒漿酒精度顯著高于降酸酵母發(fā)酵酒漿(P<0.05)，且還原糖含量、殘?zhí)橇匡@著高于降酸酵母發(fā)酵的酒漿(P<0.05)。降酸酵母發(fā)酵酒漿酒精度最低，殘?zhí)橇?、還原糖最高，發(fā)酵力低于其他酵母。發(fā)酵力略低于耐低溫酵母LABA，但無(wú)明顯差異，發(fā)酵效果居中，但是前者可滴定酸含量較高，對(duì)桑葚果酒口感造成一定影響。相同時(shí)間內(nèi)耐低溫酵母LABA酒精轉(zhuǎn)換能力較好，且不會(huì)造成酸度過(guò)高，降低桑葚果酒的柔和指數(shù)。選用耐低溫酵母LABA作為桑葚果酒發(fā)酵酵母。添加酵母實(shí)驗(yàn)組于空白實(shí)驗(yàn)組相比各項(xiàng)指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，桑葚果漿空白組不添加酵母也可以啟動(dòng)自然發(fā)酵。但自然發(fā)酵起酵慢，且不穩(wěn)定，易被雜菌的污染，導(dǎo)致成品酒液之間質(zhì)量差異大。圖1

注：不同小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異(P<0.05)，下同

2.2 不同酵母濃度對(duì)桑葚果酒主發(fā)酵的影響

研究表明，添加酵母實(shí)驗(yàn)組于空白實(shí)驗(yàn)組相比各項(xiàng)指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，不同酵母添加量的主發(fā)酵結(jié)果仍存在一定差異。當(dāng)酵母添加量為0.1 g/kg時(shí)，發(fā)酵效果低于其他酵母。0.2與0.3 g/kg酵母添加量發(fā)酵效果無(wú)明顯差異，0.2 g/kg酵母添加量酒漿酒精度最高的。選用桑葚果酒主發(fā)酵酵母添加量為0.2 g/kg。圖2

圖2 不同酵母濃度下桑葚果酒酒精度、pH、還原糖、殘?zhí)橇?、可滴定酸變?/p>

2.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)桑葚酒主發(fā)酵的影響

研究表明，發(fā)酵溫度對(duì)桑葚果酒主發(fā)酵過(guò)程中pH和可滴定酸的影響較大，當(dāng)發(fā)酵溫度在24～26℃時(shí)，桑葚酒漿pH值最小，且可滴定酸含量顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，對(duì)桑葚果酒口感造成一定影響?？傻味ㄋ崾窃u(píng)價(jià)果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，合適的酸度可以使桑葚果酒酒體協(xié)調(diào)，口感酸甜；若可滴定酸含量過(guò)高，將帶來(lái)尖酸感和不愉快的醋味，降低桑葚果酒的柔和指數(shù)，其感官風(fēng)味與整體品質(zhì)造成一定影響；在桑葚果酒主發(fā)酵過(guò)程中，可滴定酸含量過(guò)高，會(huì)影響酵母中后期發(fā)酵能力，導(dǎo)致發(fā)酵異常。圖3

圖3 不同發(fā)酵溫度下桑葚果酒酒精度、pH、還原糖、殘?zhí)橇?、可滴定酸變?/p>

2.4 響應(yīng)面多元回歸模型

研究表明，桑葚果酒主發(fā)酵工藝參數(shù)的二次回歸方程為：Y=11.28+0.062A+0.59B+0.20C+0.050AB-0.27AC-0.23BC-0.44A2-0.59B2-0.015C2。該方程的多元相關(guān)系數(shù)R2為0.946 0，該回歸模型與實(shí)際結(jié)果擬合較好。表3

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

研究表明，模型的顯著性水平P<0.01，該二次方程模型極為顯著，通過(guò)因素之間交互作用3D響應(yīng)面曲面圖，以及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)有顯著的交互作用的因素為SO2添加量和酵母濃度，其他因素之間交互效應(yīng)不顯著。利用模型得到桑葚果酒最佳主發(fā)酵工藝條件為酵母濃度0.222 5 mg/kg、發(fā)酵溫度21.192～23.192℃、SO2添加量為80 mg/kg，預(yù)測(cè)酒精度為11.543%vol。最優(yōu)工藝條件調(diào)整為酵母濃度0.22 mg/kg、發(fā)酵溫度21～23℃、SO2添加量為80 mg/kg，測(cè)得酒精度為11.3%，實(shí)際測(cè)量值接近預(yù)測(cè)值，回歸模型有效。表4，圖4

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸模型方差

圖4 因素之間交互作用3D響應(yīng)曲面

2.5 桑葚果酒香氣

研究表明，桑葚果酒共檢測(cè)出24種揮發(fā)性香氣化合物，酯類化合物相對(duì)含量最高(77.861%)，相對(duì)含量排在前3位的酯類物質(zhì)分別為：癸酸乙酯(20.163%)、月桂酸乙酯(16.716%)、辛酸乙酯(9.659%)，帶給桑葚果酒果香、甜香等多樣香氣。其次醇類化合物相對(duì)含量排名第二(19.066%)，包括乙醇(17.972%)與苯乙醇(1.094%)。表5

表5 各處理酒樣中揮發(fā)性香氣化合物的 GC-MS 分析

2.6 桑葚果酒理化指標(biāo)

研究表明，最優(yōu)主發(fā)酵工藝得到的桑葚果酒，入口酸甜可口、濃郁豐富，色澤光亮、呈濃郁的紫紅色，酒香和諧、具有獨(dú)特桑葚果實(shí)香氣。雖然無(wú)明顯懸浮物和沉淀物，但是澄清度較低，需要在陳釀步驟后，利用化學(xué)澄清劑以及機(jī)械澄清技術(shù)，使桑葚果酒最終成品外觀澄清透亮。表6，圖5

表6 桑葚果酒理化指標(biāo)

圖5 感官分析雷達(dá)圖

3 討 論

醇類化合物在桑葚果酒中既是芳香物質(zhì)，又是呈味物質(zhì)，其中苯乙醇帶給酒體一種玫瑰花香和甜香[20]。當(dāng)酵母添加量過(guò)低時(shí)，發(fā)酵效果低于其他酵母。因?yàn)榻湍柑砑恿窟^(guò)小，酵母菌增殖緩慢，在主發(fā)酵初始階段易被雜菌污染，且限制酒漿酒精度增長(zhǎng)。若酵母添加量過(guò)高，起酵快，酵母菌迅速增殖，可避免雜菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生酒液多，但過(guò)多添加量會(huì)使酒漿發(fā)酵過(guò)快，導(dǎo)致影響桑葚果酒感官風(fēng)味的產(chǎn)物積累過(guò)多，并且會(huì)增加成本，這與吳夢(mèng)[20]研究結(jié)果一致。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度對(duì)桑葚果酒主發(fā)酵過(guò)程中pH和可滴定酸的影響較大，姚遠(yuǎn)[21]對(duì)桑葚米酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化也得出結(jié)論隨著發(fā)酵溫度的提高，發(fā)酵速度過(guò)快，會(huì)導(dǎo)致酒樣酸度增高，口感變酸、變澀影響食用品質(zhì)?？傻味ㄋ崾窃u(píng)價(jià)果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，合適的酸度可以使桑葚果酒酒體協(xié)調(diào)，口感酸甜；若可滴定酸含量過(guò)高，將給人帶來(lái)尖酸感和不愉快的醋味，降低桑葚果酒的柔和指數(shù)，其感官風(fēng)味與整體品質(zhì)造成一定影響；同時(shí)，在桑葚果酒主發(fā)酵過(guò)程中，可滴定酸含量過(guò)高，會(huì)影響酵母中后期發(fā)酵能力，導(dǎo)致發(fā)酵異常。通過(guò)SPME-GC/MS檢測(cè)分析，桑葚果酒香氣化合物中酯類化合物與醇類化合物相對(duì)含量較高，對(duì)酒體品質(zhì)的優(yōu)劣有相當(dāng)重要的作用，帶給桑葚果酒果香、甜香等多樣香氣，在醇類香氣中以發(fā)酵產(chǎn)生的苯乙醇為主，具有柔和持久的玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等多樣風(fēng)味，對(duì)果酒香氣的形成有積極作用，這與孫佳勰等[22]研究結(jié)果一致。通過(guò)感官分析可知，利用最優(yōu)主發(fā)酵工藝得到的桑葚果酒品質(zhì)優(yōu)，但是余味較短，澄清度較低，需要進(jìn)行陳釀澄清步驟。同時(shí)桑葚果酒總酚、總黃酮、花色苷含量均高于現(xiàn)有研究制得的發(fā)酵型桑葚酒，考慮進(jìn)一步研究其抗氧化能力。

4 結(jié) 論

桑葚果酒最優(yōu)主發(fā)酵工藝參數(shù)：酵母添加量0.22 g/kg、發(fā)酵溫度21～23 ℃、SO2添加量為80 mg/kg。通過(guò)最優(yōu)主發(fā)酵工藝得到的桑葚果酒不僅口感佳，色澤濃郁紫紅色，具有獨(dú)特桑葚果實(shí)香氣，利用SPME-GC/MS技術(shù)共檢測(cè)出24種揮發(fā)性香氣化合物，酯類化合物相對(duì)含量最高(77.861%)，其次醇類化合物(19.066%)。