解先利，劉云云，余強(qiáng)，張宇，張榮清，邱雨心

（1 陜西科技大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2 中國科學(xué)院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640）

化石燃料儲量有限以及燃燒過程引發(fā)的環(huán)境問題（如空氣污染、溫室效應(yīng)），使得以農(nóng)林廢棄物、市政固體廢棄物和工業(yè)廢料等廢棄物為原料的燃料乙醇成為頗具前景的綠色替代能源。使用可再生的燃料乙醇可減少溫室氣體排放，因為農(nóng)作物生長過程吸收的CO和其轉(zhuǎn)化為燃料后燃燒排放的CO量相當(dāng)，可達(dá)到碳中和，因此發(fā)展燃料乙醇對維持生態(tài)平衡具有重要意義。

近年來，中藥業(yè)在我國蓬勃發(fā)展，其生產(chǎn)加工過程產(chǎn)生的中藥渣呈逐步增加趨勢，每年排放量約有(6000～7000)萬噸。傳統(tǒng)的中藥渣大多采用廢棄、填埋以及焚燒等方法處理，造成了資源浪費和環(huán)境污染問題。中藥渣作為生物質(zhì)的一種，其含有豐富的纖維素、半纖維素等多糖以及木質(zhì)素組分，采用生物、熱化學(xué)等技術(shù)可將其轉(zhuǎn)化為燃料和高附加值能源產(chǎn)品。

生物質(zhì)轉(zhuǎn)化燃料乙醇一般需要經(jīng)過預(yù)處理、酶水解和發(fā)酵過程。預(yù)處理主要目的是打破原料致密復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，對后續(xù)酶水解至關(guān)重要。預(yù)處理方法主要有物理法（機(jī)械法、微波處理法和超聲波處理法等）、化學(xué)法（酸法、堿法和高溫液態(tài)水等）以及有機(jī)溶劑法（離子液體）等。低共熔溶劑（DES）作為有機(jī)溶劑的一種，因具有易制備、成本低、易回收等優(yōu)勢，近年來受到廣泛關(guān)注。DES 又稱類離子液體，通常是由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）通過分子間氫鍵形成均一、穩(wěn)定的綠色溶劑，且混合物熔點低于任意組分熔點。HBA 通常為氯化膽堿等，HBD 一般為羧酸、酰胺和多元醇等。Li 等以氯化膽堿為氫鍵受體，乳酸為氫鍵供體，在不同摩爾比下分別合成DES 對稻草進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)在90℃、氯化膽堿∶乳酸摩爾比為1∶3 條件下，反應(yīng)3h，木質(zhì)素和半纖維被有效去除。Zhang等用氯化膽堿/一元羧酸、氯化膽堿/二元羧酸和氯化膽堿/多元醇預(yù)處理玉米芯，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素脫除和酶水解效率的提高與酸量、酸強(qiáng)度和氫鍵供體的性質(zhì)有關(guān)，高效DES 對原料預(yù)處理效果至關(guān)重要。

本文以甘草中藥渣為原料，在前期實驗基礎(chǔ)上，以氯化膽堿（ChCl）為氫鍵受體（HBA）、乙醇胺（M）為氫鍵供體（HBD），在摩爾比1∶5 條件下合成DES，考察了DES體系不同溫度、時間和固液比對預(yù)處理前后甘草渣化學(xué)組分和酶解效果的影響，并利用類分形動力學(xué)、掃描電鏡（SEM）、X 射線洐射儀（XRD）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對相關(guān)反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甘草渣由中國四川神農(nóng)藥業(yè)有限公司提供，原料洗滌，烘干粉碎后，過篩至20～60目之間，儲存在密封袋于干燥皿中保存，備用。纖維素酶，由丹麥諾維信（NovezymesA/S）生物工程有限公司提供，其濾紙酶活為221FPU/mL；實驗過程中所用的氯化膽堿、乙醇胺、檸檬酸、檸檬酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 中藥渣預(yù)處理

1.2.1 DES制備

氯化膽堿與乙醇胺以1∶5（摩爾比）混合，在80℃下150mL 耐壓瓶中攪拌直到形成均一透明的液體，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至血清瓶內(nèi)置于干燥器內(nèi)室溫保存。

1.2.2 ChCl-M預(yù)處理中藥渣

將上述制備好的DES 和甘草渣底物按照一定比例加入到100mL 的高溫反應(yīng)釜內(nèi)，加熱攪拌（500r/min）使之充分混合并反應(yīng)一定時間后，固液分離，用100mL G3 砂芯漏斗過濾出固相底物，收集濾液和底物用于分析。DES預(yù)處理主要考察了反應(yīng)溫度（80℃、100℃、120℃）、固液比（1∶10、1∶15、1∶20）和反應(yīng)時間（1h、2h、3h、4h）對底物組分變化和酶解效果的影響，以期獲得較優(yōu)的DES預(yù)處理體系。

1.3 酶解糖化

將1g（絕干物料）未處理或預(yù)處理后的甘草渣裝于50mL 具塞三角瓶中，加入一定量pH 為4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液和0.3%抗生素以抑制雜菌生長，反應(yīng)底物濃度為50g/L，總體積20mL，纖維素酶添加量為20FPU/g 絕干底物，在50℃、150r/min 搖床酶解96h。反應(yīng)過程中定時取樣，樣品在12000r/min 離心10min 后取上清液，用高效液相色譜儀（HPLC）測定水解液中葡萄糖、木糖等單糖含量。酶解效率計算如式(1)所示。

式中，為酶解效率，%；、分別為水解液中葡萄糖和木糖濃度，g/L；、分別為原料中葡聚糖和木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；為絕干物料底物濃度，g/L；1.11和1.14分別為葡萄糖轉(zhuǎn)換為葡聚糖的脫水系數(shù)和木糖轉(zhuǎn)換為木聚糖的脫水系數(shù)。

1.4 分析方法

1.4.1 原料組分分析

甘草渣預(yù)處理前后原料化學(xué)組分變化根據(jù)美國可再生能源實驗室（NREL）標(biāo)準(zhǔn)分析方法進(jìn)行測定。首先稱取150mg±5mg待測樣品于2mL離心管內(nèi)，加入1.5mL 72%硫酸搖勻并置于30℃、150r/min 搖床下水解1h，待反應(yīng)結(jié)束后用42mL去離子水將水解產(chǎn)物完全洗滌至75mL 耐壓瓶中（此時硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%）。然后將洗滌完的水解產(chǎn)物蓋緊瓶塞，放入高壓滅菌鍋于121℃反應(yīng)1h充分水解，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。在烘干至恒重的砂芯漏斗中進(jìn)行固液分離。固相部分于105℃烘箱烘干至恒重，計算酸不溶木質(zhì)素含量。濾液用碳酸鈣中和、離心并用2.5mL 注射器取1mL 上清液經(jīng)過0.22μm 濾膜轉(zhuǎn)移至液相瓶中，置于高效液相色譜（HPLC）中檢測葡萄糖、木糖濃度，再計算出原料中多糖的含量。固體回收率、纖維素保留率、半纖維素和木質(zhì)素去除率按照式(2)～式(5)進(jìn)行計算。

1.4.2 糖濃度分析

酶水解液中單糖濃度采用HPLC waters2695進(jìn)行檢測，色譜柱為Shodex sugar SH-1011 糖柱，溫度為50℃，流動相為0.5mmol/L HSO，流速為0.5mL/min，檢測器為RI（refractive index），檢測器溫度為50℃。

1.4.3 表征與結(jié)構(gòu)分析

（1）掃描電鏡（SEM）分析 稱適量干燥后的樣品在真空條件下噴金，通過SEM（Hitachi，S-4800）在2.0kV加速電壓下獲取樣品形貌變化的電鏡圖。

（2）結(jié)晶指數(shù)XRD 分析 采用荷蘭帕納科公司X’Pert Pro MPD（PW3040/60）型X 射線衍射儀進(jìn)行分析測定，測定條件為：反射法、Cu 靶、電壓40kV、電流40mA、掃描范圍為5°～80°。結(jié)晶指數(shù)（crystallinity index，CrI）計算為式(6)。

式中，為002 衍射面的結(jié)晶強(qiáng)度（2=22.5°）；為基線的衍射強(qiáng)度（2=18.4°）。

（3）傅里葉變換紅外光譜FTIR 分析 將樣品于60℃烘箱烘干至恒重，取1mg樣品與150mg左右溴化鉀混合，充分研磨后，用壓片機(jī)壓制，制好后的樣品放入檢測器檢測。檢測器采用德國布魯克（Bruker）公司Nicolet IS 50型FTIR分析儀，測量波長范圍為4000～600cm，掃描次數(shù)為32次。

1.5 類分形動力學(xué)模型

不溶性纖維底物的酶解過程是復(fù)雜的固-液兩相催化過程，往往還發(fā)生在分形表面上，隨著反應(yīng)進(jìn)行，底物變得越難酶解，使得反應(yīng)速率常數(shù)隨著反應(yīng)的進(jìn)行不斷減小，故研究者通過假定速率常數(shù)與時間的關(guān)系提出了類分形動力學(xué)，且該模型具有方程簡單、參數(shù)少及易確定等優(yōu)點。據(jù)此，本文根據(jù)類分形理論，假定速率常數(shù)與時間呈冪函數(shù)關(guān)系，建立了葡聚糖和木聚糖水解的類分形動力學(xué)模型，分別如式(7)和式(8)所示。

式中，和分別為酶解過程的葡萄糖和木糖的得率；和分別和為底物葡聚糖和木聚糖水解反應(yīng)速率常數(shù)；和分別為底物葡聚糖和木聚糖的分形維數(shù)；0.9 為葡萄糖換算為葡聚糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)；0.88為木糖換算為木聚糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES體系預(yù)處理條件的優(yōu)化

2.1.1 預(yù)處理溫度對殘渣化學(xué)組分影響

反應(yīng)溫度是影響DES 體系預(yù)處理效果的關(guān)鍵因素，本研究在固液比為1∶20、反應(yīng)時間為3h條件下，考察DES體系不同反應(yīng)溫度（80℃、100℃、120℃）對甘草渣化學(xué)成分的影響。預(yù)處理前后甘草渣各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化見表1。

表1 ChCl-M體系不同預(yù)處理溫度對底物組分的影響

由表1可以看出，相比于未處理的甘草渣，DES體系預(yù)處理溫度為120℃時，甘草渣中大部分的木質(zhì)素和小部分的半纖維素被去除（去除率分別為77.86%和33.85%）；葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從44.02%增加到61.98%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從19.92%下降到7.25%，木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持不變。可能原因是隨著反應(yīng)溫度的升高，DES預(yù)處理液中的氫鍵作用增強(qiáng)，其選擇性與半纖維素和木質(zhì)素組分反應(yīng)并打破其結(jié)合鍵，使木質(zhì)素和半纖維素的去除率增加，ChCl-M體系預(yù)處理對原料脫木質(zhì)素效果更好；另外，溫度的升高，使得部分纖維素溶解在DES中，由表1也可看出，木質(zhì)素去除率隨溫度升高而增加，而葡聚糖的回收率隨溫度升高而降低，120℃時纖維素保留率已經(jīng)降低到85.63%，為了最大限度去除木質(zhì)素并回收纖維素，以利于底物后續(xù)的酶催化降解過程，超過120℃的實驗結(jié)果本文就不作比較，因此在實驗溫度范圍內(nèi)選擇120℃作為后續(xù)反應(yīng)條件。

2.1.2 預(yù)處理固液比對殘渣化學(xué)組分影響

在以上實驗基礎(chǔ)上，研究預(yù)處理固液比對原料組分的影響。實驗過程預(yù)處理溫度選擇120℃，反應(yīng)時間為3h，考察DES和底物不同固液比（1∶10、1∶15、1∶20）對甘草渣化學(xué)組分的影響，預(yù)處理后甘草渣各組分變化見表2。

表2 ChCl-M體系下不同固液比對底物組分的影響

由表2可以看出，隨著DES和底物固液比的降低，物料回收率隨之降低，固液比為1∶20時，預(yù)處理效果較好，半纖維和木質(zhì)素去除率可分別可達(dá)到33.85%和77.86%，而纖維素回收率也在85.63%，相對較高。相反，在固液比為1∶10時，半纖維素和木質(zhì)素的去除率相對較低，分別為31.40%和75.86%。

可能原因是在DES 和底物固液比1∶10 條件下，DES體系整體黏度較大，底物濃度較高，傳質(zhì)傳熱可能受限，影響了原料表面和DES 溶劑組分的充分接觸，造成其對半纖維素和木質(zhì)素的降解能力下降，纖維素組分也保留率較高?？傮w上ChCl-M體系預(yù)處理對原料脫木質(zhì)素效果更好，推測是預(yù)處理液中某些組分更易與通過碳碳鍵和醚鍵連接而成的苯丙烷單體分子結(jié)合反應(yīng)，使其化學(xué)鍵斷裂進(jìn)而去除。另外，隨著固液比的降低，纖維素組分在DES中溶解的越多，由表2也可看出，葡聚糖的回收率隨固液比的降低而降低。為了最大限度去除木質(zhì)素，保留纖維素組分，選擇1∶20進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.1.3 預(yù)處理時間對殘渣化學(xué)組分影響

反應(yīng)時間是影響DES 體系催化反應(yīng)的另一重要因素。本文在以上實驗基礎(chǔ)上，在預(yù)處理溫度120℃、固液比1∶20 的條件下，考察不同預(yù)處理時間（1h、2h、3h、4h）對甘草渣化學(xué)組分的影響，實驗結(jié)果見表3。

表3 ChCl-M體系下不同預(yù)處理時間對底物化學(xué)組分的影響

由表3可以看出，當(dāng)預(yù)處理時間為4h時木質(zhì)素去除率最高，達(dá)到78.42%；預(yù)處理時間為1h 時，葡聚糖回收率最高，為93.47%。在預(yù)處理時間為2h 后，物料回收率和半纖維素去除率的差別并不大?？赡茉蚴请S著反應(yīng)時間的延長，部分底物降解之后，預(yù)處理溶劑DES 和未反應(yīng)底物之間得到充分接觸，反應(yīng)更完全，因此，底物中的半纖維素和木質(zhì)素在預(yù)處理4h后其去除率相對較高。由表2也可看出，葡聚糖的回收率隨反應(yīng)時間的增加而降低，綜合考慮最大限度去除木質(zhì)素和回收葡聚糖（葡聚糖回收率大于83%），選擇預(yù)處理時間4h 為本實驗范圍內(nèi)較優(yōu)預(yù)處理時間。

2.2 不同預(yù)處理殘渣對酶解效果影響分析

為進(jìn)一步評價預(yù)處理效果，對ChCl-M 體系不同預(yù)處理條件所得底物及未處理原料進(jìn)行酶水解實驗，考察DES 體系預(yù)處理對甘草渣酶水解效果的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1(a)可看出，隨著預(yù)處理溫度的升高，底物水解液中葡萄糖、木糖濃度和纖維素酶解率均呈現(xiàn)明顯的增加趨勢。可能原因是隨著溫度升高，木質(zhì)素去除率升高，導(dǎo)致酶解效率增加。在120℃條件下，葡萄糖、木糖濃度和纖維素酶解率均有最大值，分別為23.65g/L、6.40g/L 和72.42%。由圖1(b)可以看出，DES 和底物的固液比對底物酶水解影響不太大。結(jié)合表2 分析推測，可能是底物組分的含量變化不大所導(dǎo)致。由圖1(c)可以發(fā)現(xiàn)，隨著預(yù)處理時間的延長，水解液中葡萄糖、木糖濃度和纖維素酶解率均略有增加趨勢。由表3分析可知，預(yù)處理時間增加，木質(zhì)素去除率隨之升高，因此酶解效率也隨著增加。在預(yù)處理時間為4h 時，葡萄糖、木糖濃度和纖維素酶解效率達(dá)到最大，分別為25.17g/L、6.71g/L和78.57%；較未處理中藥渣酶解得率（30.40%）提高了1.58 倍。經(jīng)過底物酶水解過程分析，可推測預(yù)處理條件對底物酶水解效果的影響為預(yù)處理溫度＞預(yù)處理時間＞固液比。

圖1 酶解96h后DES體系預(yù)處理條件對甘草渣酶解效果的影響

2.3 類分形動力學(xué)分析

為進(jìn)一步分析驗證不同預(yù)處理條件對酶水解效果的影響，將酶水解實驗數(shù)據(jù)代入分形動力學(xué)式(7)和式(8)進(jìn)行擬合。結(jié)果見圖2。由圖2 可以看出，試驗點和擬合曲線非常接近，表4～表6中的相關(guān)系數(shù)均在0.94 以上，也證明了擬合程度非常好。這表明類分形理論能夠充分地研究纖維素酶水解動力學(xué)。

圖2 類分形動力學(xué)擬合值和實驗值比較

由表4看出，不同預(yù)處理溫度葡聚糖水解的值差別不大，值差別不大；木聚糖水解的值均差別較大。底物顆粒不規(guī)則性可用分形維數(shù)衡量。原料經(jīng)過不同溫度預(yù)處理后，在表觀上顆粒尺寸大小和尺寸分布相似，這可由表中葡聚糖值接近得到證實。表4中結(jié)果可看出，不同預(yù)處理溫度所得底物與纖維素酶的有效吸附性差別較大，這與底物酶水解結(jié)果一致；不同預(yù)處理時間對半纖維素的降解影響比較大，這與表4 中的木聚糖值差別比較大結(jié)果一致。

表4 不同預(yù)處理溫度類分形動力學(xué)擬合得到的速率常數(shù)和分形維數(shù)

由表5可以看出，不同固液比的葡聚糖水解和木聚糖水解的值差別不大。結(jié)合表2 分析，同樣原料經(jīng)不同固液比預(yù)處理后，木質(zhì)素去除率和半纖維去除率差別不大，這與表5中葡聚糖水解和木聚糖水解的值差別不大結(jié)論相一致；由底物酶水解結(jié)果也驗證了不同原料脫木質(zhì)素效果，底物與纖維素酶之間的有效吸附性差別不大這一結(jié)論。

表5 不同預(yù)處理固液比類分形動力學(xué)擬合得到的速率常數(shù)和分形維數(shù)

由表6看出，不同預(yù)處理時間對葡聚糖水解的值影響不大，值略有差別；木聚糖水解的值差別較大。由表2 發(fā)現(xiàn)，原料在預(yù)處理2h 后，半纖維素和木質(zhì)素含量差別不是很大，這與表6葡聚糖值差別不大結(jié)果一致。在預(yù)處理時間4h時，半纖維含量較低以及殘渣與酶的吸附性較強(qiáng)，因此預(yù)處理時間為4h 時，酶水解效果較好，這與表中預(yù)處理時間為4h 時，葡聚糖和木聚糖較大，值較小結(jié)果一致。

表6 不同預(yù)處理時間類分形動力學(xué)擬合得到的速率常數(shù)和分形維數(shù)

2.4 殘渣表面結(jié)構(gòu)分析

對較優(yōu)條件下甘草渣ChCl-M 預(yù)處理前后底物表面形貌變化進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖3。由圖3 可以清楚地看到，未處理原料結(jié)構(gòu)緊密，表面平整光滑，結(jié)構(gòu)緊實。與原料相比，ChCl-M 體系預(yù)處理后物料表面出現(xiàn)明顯的裂痕、溝壑和大量的孔洞，纖維表面無序化，這樣更加有利于酶分子與底物接觸，經(jīng)過ChCl-M 體系預(yù)處理，原料化學(xué)組分改變導(dǎo)致表面形貌變化很明顯。

圖3 預(yù)處理前后底物的表面形貌變化（SEM）（1000倍和11000倍）

2.5 殘渣的XRD和FTIR分析

ChCl-M 體系較優(yōu)條件預(yù)處理前后底物X 射線衍射圖譜和紅外光譜圖見圖4(a)和(b)。由圖4(a)可以看出，未處理和預(yù)處理后的底物XRD分析顯示，底物中纖維素的結(jié)構(gòu)為典型的Ⅰ型纖維素，說明經(jīng)過ChCl-M 體系處理后并未改變纖維素的晶型，這與FTIR 圖譜結(jié)果相吻合。甘草渣原料中纖維素的CrI 為30.76%，當(dāng)用ChCl-M 預(yù)處理后，底物中纖維素的CrI增加至40.89%。其中有兩個相互競爭的因素決定了原料和底物的結(jié)晶度：①微晶纖維素部分的溶脹和溶解；②無定形木質(zhì)素和木聚糖的去除。CrI 值的增加表明無定形組分的去除，超過了纖維素的溶脹。這些結(jié)果表明，ChCl-M 體系預(yù)處理是有利于木質(zhì)素和木聚糖的去除，從而導(dǎo)致更高的CrI。ChCl-M預(yù)處理后，底物結(jié)晶指數(shù)明顯升高，推測原因為預(yù)處理后底物中纖維素含量明顯比原料中高。

根據(jù)文獻(xiàn)[17]，纖維素的CrI 還可以通過FTIR圖譜中1430cm的譜帶與898cm處譜帶的吸收強(qiáng)度表示。圖4(b)為ChCl-M 預(yù)處理前后底物的FTIR圖，由圖中可以發(fā)現(xiàn)，1430cm（纖維素Ⅰ）處的譜帶吸收強(qiáng)度增加，而在898cm（纖維素Ⅱ）處的譜帶吸收強(qiáng)度減弱，表明預(yù)處理后底物中纖維素的CrI增加ChCl-M預(yù)處理后樣品在3415cm（纖維素O—H 拉伸振動）和2923cm（C—H 拉伸振動），說明預(yù)處理打破了纖維素分子內(nèi)和分子間的氫鍵以及甲基/亞甲基結(jié)構(gòu)；1049cm和1155cm處的紅外吸收強(qiáng)度減弱，其分別代表半纖維素中乙?；腃═O的拉伸和C—O鍵，表明預(yù)處理過程中半纖維素部分被降解；同時，代表木質(zhì)素特征吸收峰的譜帶1319cm（紫丁香基縮合木質(zhì)素）、1552cm（苯環(huán)）和1608cm（木質(zhì)素C═O 的拉伸振動）處的紅外吸收強(qiáng)度也減弱，表明預(yù)處理過程中木質(zhì)素被脫除。這些結(jié)構(gòu)變化和上述XRD 分析結(jié)果一致，也進(jìn)一步說明了DES 預(yù)處理對甘草渣組成的影響有利于酶解效果的提高。

圖4 預(yù)處理前后底物的X射線衍射圖和FTIR吸收光譜圖

3 結(jié)論

DES具有優(yōu)良的分離木質(zhì)素的能力，相比于傳統(tǒng)脫木質(zhì)素工藝，DES 綠色環(huán)保成本低且易回收。本文在前期優(yōu)化的DES 體系基礎(chǔ)上，考察了DES預(yù)處理溫度、反應(yīng)時間和固液比對甘草渣組分和酶解效果的影響。在實驗條件范圍內(nèi)，得到120℃、1∶20、反應(yīng)4h 的較優(yōu)預(yù)處理條件，并通過酶水解效果分析和類分形動力學(xué)機(jī)理研究，探討了DES 預(yù)處理效果；最后，對較優(yōu)條件下底物進(jìn)行了表征分析，為DES 的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。未來在提高DES 脫木質(zhì)素的效率、降低生產(chǎn)成本方面，可采用聯(lián)合預(yù)處理技術(shù)，以及開發(fā)新型高效的二元和三元DES。