馬驍，鄔志鋒

（廣東交通職業(yè)技術(shù)學院，廣東 廣州 510650）

光學顯微鏡是生物學、醫(yī)學等領(lǐng)域中必不可少的重要工具之一。[1-5]它由照明裝置、載物臺、成像透鏡組和目鏡等組成。早期研究主要關(guān)注成像透鏡組的成像性能，隨著對光學顯微成像原理的深入研究，人們開始認識到照明技術(shù)在顯微成像中具有重要作用。傳統(tǒng)光學顯微鏡普遍采用柯勒照明方式，[1-5]照明光一般由鹵素燈等熱光光源提供，通過加熱燈絲發(fā)光。熱光光源的優(yōu)點是光譜寬，缺點是光能轉(zhuǎn)化率低，使用壽命短，長時間工作需要散熱裝置。此外，熱光光源燈絲需要制成特定的彎曲形狀，以增大發(fā)光面積，保證照明亮度。不能直接提供均勻的照明，需要使用復雜的光路，才能實現(xiàn)均勻的照明。

發(fā)光二極管（light emitting diode，LED） 正逐漸取代傳統(tǒng)照明光源，成為現(xiàn)代顯微成像的標準照明器件。LED 是一種單色性好，發(fā)光亮度高，沒有散斑噪聲的新式照明光源。LED光源可以直接提供均勻且高亮的照明，無需增加復雜的照明光路。LED芯片發(fā)光區(qū)域具有一定面積，可以看作是一個很小的面光源，且LED具有聚光鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)光區(qū)域每一點發(fā)出的光線經(jīng)聚光鏡，可形成一定發(fā)散角的光束，當樣品與LED光源之間距離遠大于樣品的尺寸時，照射在樣品上的光束可近似看作平行光。此外，單顆LED 體積較小，便于排列成各種陣列形式，可實現(xiàn)多入射角及多方位角的斜照明，這是柯勒照明難以做到的，更重要的是LED光源可使用最簡單的電路實現(xiàn)編程控制，為實現(xiàn)計算顯微成像提供了重要的工具。例如，采用方形排布的LED陣列光源，實現(xiàn)了數(shù)字重聚焦顯微成像[6-7]、光場顯微成像[8]、相位顯微成像[9-11]、傅里葉疊層顯微術(shù)等，[12-16]具有很高的應用價值。

由于顯微鏡成像系統(tǒng)透鏡為圓形，成像視野是圓形區(qū)域，圓環(huán)形排布的陣列LED光源，照明利用率更高、更實用。本文設(shè)計并介紹了一種環(huán)形陣列LED光源，并舉例給出了該光源在顯微成像方面的應用。

2 光源設(shè)計

常見的LED有直插式和貼片式兩種比較常見的封裝結(jié)構(gòu)，如圖1所示。

圖1a 是直插式LED 封裝結(jié)構(gòu)示意圖。直插式LED是將元件高度集成封裝，屬于結(jié)構(gòu)一體化設(shè)計。其結(jié)構(gòu)中有反光帽、透鏡等聚光結(jié)構(gòu)，且直插式LED芯片發(fā)光區(qū)較小，聚光結(jié)構(gòu)有很好的匯聚光線作用。因此，一般情況下，直插式LED發(fā)射角小，光線集中，照明距離遠，但照射范圍較小。 這里以一種高亮度直插式LED （504 LGC） 為例，圖1b 給出了這種直插式LED 的輻射角度與輻射強度關(guān)系圖，其中0 方向為LED發(fā)光中心方向，可以看到，發(fā)光集中在與發(fā)光方向夾角小于30 的區(qū)域內(nèi)，那么這種LED 的發(fā)射角（50%輻射強度時的角度） 約為15 。

圖1 兩種常見的LED封裝結(jié)構(gòu)及輻射角度示意圖

而貼片式LED，如圖1c 所示，LED 芯片固定在大面積金屬底座上，散熱能力強，且可將控制芯片集成在燈體內(nèi)，更容易實現(xiàn)編程控制。但可以看出，貼片式LED芯片，也就是發(fā)光區(qū)域更大，只有一個透鏡結(jié)構(gòu)匯集光線，發(fā)射角較大，照明范圍大，照明距離近。圖1d給出了一種三色貼片式LED （3528 RGB） 輻射角與輻射強度的關(guān)系，可以看到，發(fā)出的光集中在與發(fā)光中心夾角小于60 的區(qū)域內(nèi)，這種LED發(fā)射角約為60 。

為了便于對比兩種不同封裝的LED各自的特點，列出表格如表1所示。

表1 直插式LED和貼片式LED的特點對比

作為顯微照明光源，首先必須滿足高亮且照明均勻兩個條件。由于顯微樣品通常較小，無論是哪種LED光源，只要距離樣品足夠遠，就可以在照明中心范圍內(nèi)，為樣品提供均勻照明光。然而，對于貼片式LED，由于發(fā)射角過大，光線發(fā)散，將會造成照明光的浪費。相比之下，直插式LED發(fā)射角小，功率相同時體積小，因此，更便于排成陣列式可控光源。

由于越高倍數(shù)的顯微物鏡，需要的照明光越強。為了驗證直插式LED 可以提供足夠高的亮度且均勻的照明，這里設(shè)計了一款LED 可以配合100 倍、數(shù)值孔徑NA = 1.25 的顯微物鏡使用，設(shè)計的環(huán)形LED 陣列結(jié)構(gòu)示意圖如圖2a 和圖2b 所示，制作完成的實物環(huán)形LED 陣列光源如圖2c 所示。

圖2 LED光源結(jié)構(gòu)示意圖

環(huán)形LED 陣列光源外徑為176 mm，內(nèi)徑為140 mm，厚度15 mm，由60顆相同LED子光源等間隔均勻排列在環(huán)形內(nèi)面構(gòu)成，總發(fā)光功率24W，外殼采用的是鋁合金材質(zhì)，便于散熱。每個LED子光源的中心波長為520 nm，發(fā)光帶寬為10 nm，單顆LED子光源發(fā)光功率0.4 W，發(fā)射角約17.5 。每個LED 發(fā)光指向樣品，LED 距離樣品34mm，計算出LED 發(fā)光中心光束與燈環(huán)平面夾角，也就是入射角約為64 ，照明數(shù)值孔徑約為0.9。剛好與柯勒照明可提供的最大照明數(shù)值孔徑相等。

由于需要對環(huán)形LED 陣列光源進行編程控制，我們設(shè)計制作了光源控制電路板，如圖3所示。

圖3 環(huán)形LED陣列光源控制電路板

光源控制電路由控制模塊和電源管理模塊構(gòu)成的?？刂颇K分為主控部分和輔助控制部分，主控部分由32 位單片機（STM32F103） 和移位寄存器組成。移位寄存器用于擴展IO 口數(shù)目。輔助控制部分由USB 總線轉(zhuǎn)接芯片（CH340G）等元件組成。電源管理模塊提供穩(wěn)壓直流供電。使用前通過ST-link，將LED 環(huán)形斜照明光源控制程序燒錄至單片機。使用時，通過USB串口向單片機發(fā)送指令，實現(xiàn)對多個LED子光源的獨立控制，進而可以實現(xiàn)不同組合的照明方式。

3 環(huán)形LED陣列光源顯微成像實驗

圖4 所示是使用設(shè)計好的環(huán)形LED 陣列光源，在標準透射式的明場顯微鏡（Nikon 80-i）光路上搭建的成像系統(tǒng)。搭建過程十分簡單，只要將光源中心對準光軸，光源水平固定在載物臺下方，光源LED 所在平面距離樣品34 mm 即可。使用的物鏡是100倍、NA = 1.25的尼康平場消色差油鏡，CMOS 相機（Andor，Zyla 4.2P） 像素大小為6.5 μm。由于環(huán)形LED陣列光源可提高明場顯微橫向和軸向分辨率，可以對樣品進行光切片成像，這里使用一個Z 軸納米位移臺在Z 軸方向上進行切片成像。對比實驗中柯勒照明設(shè)置照明數(shù)值孔徑也為0.9。

圖4 環(huán)形LED陣列照明顯微成像裝置

采用上述結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)多種顯微成像，例如圖5 是硅藻的斜照明成像結(jié)果，這種成像是使用單顆LED在一個照明方位角實現(xiàn)的，圖中照明方位從上至下，可以清晰看到硅藻內(nèi)部結(jié)構(gòu)。斜照明成像[17]適合本身透明且未染色的樣品成像，得到的是相位梯度像，[11,18]可顯示出透明樣品的結(jié)構(gòu)細節(jié)，而柯勒照明一般不用于未染色透明樣品成像，對比度低且噪聲大。

圖5 硅藻的斜照明圖像

60 個LED 全部點亮可以實現(xiàn)光切片成像。[19-20]圖6 是銀納米線的光切片圖像，圖6 a～c 是柯勒照明下圖像，相鄰圖像間Z 軸方向相差360 nm。圖6 d～f 是環(huán)形LED陣列照明下的圖像，相鄰圖像間Z 軸方向相差360nm?？梢钥吹?，在環(huán)形LED陣列照明下，銀納米線從離焦到聚焦，再從聚焦到離焦的現(xiàn)象十分明顯，說明所設(shè)計的光源，可以提高顯微成像的軸向分辨率。且環(huán)形LED陣列光源照明下顯微圖像比柯勒照明顯微圖像中銀納米線明顯更細，說明分辨率更高。

圖6 銀納米線光切片成像

將環(huán)形LED陣列光源上相對的LED子光源一對一對分別點亮，得到對稱斜照明圖像，然后通過一定算法，可以實現(xiàn)計算斜照明顯微成像[21]，屬于綜合孔徑分辨率增強成像。圖7是與柯勒照明成像對比圖?？梢钥吹剑嬎阈闭彰黠@微成像的分辨率明顯更高。

圖7 計算斜照明顯微成像與柯勒照明成像對比圖

4 結(jié)論

本文簡要介紹了近年來LED光源在光學顯微成像技術(shù)中的應用，以及兩種常見的LED封裝結(jié)構(gòu)，并給出了一種環(huán)形LED 陣列光源的設(shè)計方案。通過斜照明、光切片、計算斜照明顯微成像等實驗，展示了一種環(huán)形LED陣列光源在光學顯微成像中的應用。