盤 涌，羅彩神，覃日宏，柳賢福，梁 芳

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

糯米藤Gonostegiahirta，又名捆仙繩、糯米菜、糯米草等，為蕁麻科糯米團屬植物[1]，糯米藤，性平，味甘，無毒；具清熱解毒、健脾、消腫散瘀功效。主要用于治療腫毒、痢疾、消化不良、痛經(jīng)等；外敷可以治療跌打損傷；對于咳血、吐血、外傷出血也有很好的止血消炎作用[2]。糯米藤作為我國苗族傳統(tǒng)用藥，多為南方地區(qū)用藥，在貴州民間治療各類疾病，尤其是對骨折和消化系統(tǒng)疾病患者有較好的效果。糯米藤中化學(xué)成分有一定的研究，化學(xué)成分雖較明確，但基礎(chǔ)研究薄弱，空白點較多[3-6]。目前該藥材尚未被收入《藥典》標準，缺少有效的質(zhì)量控制方法，制約著該植物的開發(fā)利用，目前尚未有文獻報道其有效成分質(zhì)量控制方法。本項目以糯米藤為研究對象，采用采用HPLC法測定糯米藤中槲皮素和山柰酚含量，為糯米藤的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實 驗

1.1 儀 器

Agilent1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司；B3500S-MT超聲清洗儀，上海必能信超聲有限公司；Millipore Simplicity-185超純水儀，美國密里博公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；BP211D電子分析天平，德國賽多利斯； SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 試 藥

對照品槲皮素(批號：3467，HPLC純度≥99.30%)、山柰酚(批號：6990，HPLC純度≥99.90%)，均購于上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司；糯米藤于2021年8月分別采至廣西南寧市、廣西柳州市和廣西百色市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院中藥鑒定教研室苑敏副教授鑒定為蕁麻科糯米團屬植物糯米藤的全草。甲醇(色譜純)，美國Fisher科學(xué)世界公司；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為X-Peonyx C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(55:45)；檢測波長為360 nm；流速為1.0 mL·min-1。柱溫30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的槲皮素和山柰酚對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含0.16 mg、0.022 mg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取糯米藤粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲提取40 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得[7]。

2.4 專屬性試驗

分別精密吸取上述混合對照品溶液和糯米藤供試品溶液各10 μL進樣分析，結(jié)果見圖1。槲皮素和山奈酚的保留時間分別為8.9和13.5 min，與各自相鄰峰的分離度>1.5。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)的色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項下對照品溶液1，2，4，8，10 mL分別稀釋到10 mL容量瓶中，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀進行分析，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得到槲皮素回歸方程為Y=3946.2X+64.451， (r=0.9999)，山柰酚回歸方程為Y=7901.7X-33.716，(r=0.9999)。結(jié)果表明，槲皮素和山柰酚分別在0.16～1.6 μg，0.022～0.22 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣 6次，計算槲皮素和山柰酚的峰面積RSD分別為0.96%和0.89%。表明儀器精密度良好(表1)。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗

取廣西南寧糯米藤樣品，按“2.3”項下方法分別制備 6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，按回歸方程計算槲皮素和山柰酚含量。結(jié)果平均含量分別為0.3841 mg·g-1和0.09793 mg·g-1，RSD分別為1.01%和1.79%。表明方法重復(fù)性良好(表2)。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品(批號1102091)，按“2.1”項下色譜條件分別在0，2，6，10，16，24 h進樣10 μL，測定槲皮素和山柰酚的峰面積，RSD分別為1.18%和1.66%(n=6)。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定(表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量廣西南寧糯米藤樣品6份，分別精密加入一定量的槲皮素和山柰酚對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，測定槲皮素和山柰酚的含量。平均回收率分別為98.77%和99.29%，RSD分別為0.92%和1.91%，表明該方法可靠，準確度高。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率的實驗結(jié)果(n=6)

2.10 樣品的測定

精密稱取3批糯米藤1 g，每批3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定其中槲皮素和山柰酚的含量，結(jié)果見表5。

表5 含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本文采用DAD檢測器，經(jīng)全波長掃描得到糯米藤的3D圖譜，結(jié)果顯示在波長為360 nm處，槲皮素和山柰酚吸收最好，靈敏度最高，故選擇360 nm作為測定波長，考察了回流提取、索氏提取、超聲提取、冷浸4種提取方法，結(jié)果顯示超聲提取較好，且操作簡便?？疾炝思状己鸵掖純煞N提取溶劑，結(jié)果表明以甲醇作為提取溶劑提取率較高，分離度好，對稱因子接近1，且干擾少，故選用甲醇作為提取溶劑。

本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液4種流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示以甲醇-0.2%磷酸溶液(55:45)為流動相，分離度較好(R>1.5)，保留時間適中，峰形亦較好。

樣品測定結(jié)果表明，采收至廣西不同地區(qū)的3批糯米藤樣品所含的槲皮素和山柰酚的含量差別不大，質(zhì)量相對比較穩(wěn)定。本文建立的槲皮素和山柰酚含量測定方法，可以較好地反映糯米藤中槲皮素和山柰酚的含量，結(jié)果準確，重復(fù)性良好，對糯米藤的質(zhì)量控制有一定意義。