楊 俊，梁玉清，尹彩霞，梁光平，王丹丹

(1 遵義醫(yī)藥高等?？茖W校，貴州 遵義 563006;2 銅仁職業(yè)技術學院，貴州 銅仁 554300)

據估計，2020年全球約有1930萬新發(fā)癌癥病例，女性乳腺癌已超過肺癌成為最常見的癌癥，有近230萬病例，其次是肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胃癌；在近1000萬癌癥死亡病例中，肺癌仍然是癌癥死亡的主要原因，其次是結腸直腸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌，癌癥依舊是威脅人類健康的主要原因之一[1-2]。吲唑結構廣泛的存在于活性化合物和藥物之中，其中較為突出的是抗腫瘤活性，如：Entrectinib[3]用于治療 12歲以上的的成人和兒童患者的神經營養(yǎng)性酪氨酸受體激酶(NTRK)融合陽性的實體瘤和ROS1陽性轉移非小細胞肺癌；1[4]作為有效的選擇性PAK1抑制劑，具有抗腫瘤遷移和侵襲活性；Bozitinib[5]是一種有效的高選擇性c-MET抑制劑，在體外和體內 NSCLC模型中均顯示出優(yōu)異的活性。小蘗科鬼臼屬桃兒七、山荷葉、美洲鬼臼等植物，民間曾用于治療尖銳濕疣、牛皮癬等疾病，鬼臼毒素(Podophyllotoxin)是在其根或莖中提取得到的一種具有顯著的抗腫瘤作用的芳基萘類木脂素，其突出的抗腫瘤作用主要機制為，抑制微管蛋白聚合[6]，抑制拓撲異構酶Ⅱ活性[7-8]，自由基機制[9]，由鬼臼毒素進行結構修飾的依托泊苷等藥物，因為耐藥性及水溶性差限制其應用?；谔烊换钚援a物鬼臼毒素良好的抗腫瘤活性及吲唑抗腫瘤活性骨架，我們根據前藥和藥物拼合原理，通過丁二酸酐將吲唑活性骨架與鬼臼毒素進行拼接，尋找抗腫瘤活性較好的活性分子，同時可能解決依托泊苷的腫瘤耐藥性問題。

圖1 設計思路

1 儀器、試劑與細胞

1.1 主要儀器

ATY224型電子天平，日本島津公司；SGW X-4顯微熔點儀，上海儀電物理光學儀器有限公司；RE-2000B型旋轉蒸發(fā)儀，鞏義市瑞德儀器設備有限公司；Bruker Avance Ⅲ 400MHZ核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)，德國布魯克公司；WFH-203B型暗箱式紫外分析儀，上海亮研智能科技有限公司；Aglient 1290-6545高分辨質譜儀，安捷倫科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州集團安泰空氣技術有限公司；Flexstation 3酶標儀，美國分子儀器公司；MCO-15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱，SANYO 公司。

1.2 藥物與試劑

5-溴吲唑(純度> 98.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺(純度>98.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鬼臼毒素(純度>98.0%)，上海麥克林生化科技有限公司；丁二酸酐(純度>98.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(純度>98.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-二甲氨基吡啶(純度>99.0%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；噻唑藍(批號3580MG250)，Biofroxx公司；優(yōu)級胎牛血清Fetal Bovine Serum(批號10091-148)，Gibco公司；青霉素/鏈霉素溶液Penicillin-Streptomycin(批號15070-063)，Gibco公司。

1.3 細 胞

人非小細胞肺癌細胞(A549)、人肺腺癌耐順鉑株(A549/DDP)、人乳腺癌細胞(MCF-7)，均購自Procell公司，所有細胞株均在液氮中凍存，需要時復蘇。

2 方 法

2.1 新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的合成

2.1.1 N-丁二酸單取代-5-溴吲唑的合成

在反應管中依次加入197.0 mg 5-溴-1H-吲唑(1 mmol)，170.2 mg 丁二酸酐(1.7 eq，1.7 mmol)，12.6 mg 催化劑4-二甲氨基吡啶(10%)，0.5 mL三乙胺和3 mL二氯甲烷溶液，回流反應12 h，TLC檢測基本反應完全，旋干溶劑，加入 30 mL乙酸乙酯稀釋，然后加入1 M鹽酸溶液，乙酸乙酯反復萃取，合并乙酸乙酯層，旋干溶劑上樣經硅膠柱層析(洗脫劑：V(石油醚)：V(乙酸乙酯)= 2:1)純化得N-丁二酸單取代-5-溴吲唑。

圖2 新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的合成

2.1.2 新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的合成

取N-丁二酸單取代-5-溴吲唑177.0 mg(0.6 mmol)，207.2 mg鬼臼毒素(0.5 mmol)，12.3 mg催化劑4-二甲氨基吡啶，154.8 mg脫水劑N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺，4 mL二氯甲烷溶液于反應管之中，TLC檢測基本反應完全，加入30 mL二氯甲烷稀釋，加入0.1 N稀鹽酸50 mL萃取，取二氯甲烷層，分別用飽和碳酸氫酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋干二氯甲烷層上樣經硅膠柱層析(洗脫劑:V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1 至2:1)純化得最終產物新型吲唑拼接鬼臼毒素化合物。

2.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)，以A549/DDP細胞為例。將A549/DDP細胞從液氮中取出，快速放入37 ℃水浴鍋中，輕搖凍存管使凍存液溶解；溶解后把細胞轉移到含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細胞，室溫1000 rpm離心5 min，棄上清；用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細胞，接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；當細胞的密度達到80% 時，對細胞進行傳代；棄去培養(yǎng)基，用PBS洗一次；加 1～2 mL 0.25% 胰蛋白酶消化細胞，顯微鏡下觀察，消化1～2 min，可看到細胞相互分離變圓，即消化完成；快速棄去胰酶，加入完全培養(yǎng)基，吹打細胞，制成單細胞懸液，按1:3的比例傳代，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下擴大培養(yǎng)。

2.3 體外抗腫瘤活性測試

對人非小細胞肺癌細胞(A549)、人肺腺癌耐順鉑株(A549/DDP)、人乳腺癌細胞(MCF-7)的體外抗腫瘤活性測試，采用改良MTT法[10]，以A549/DDP為例。取處于對數生長期，生長狀態(tài)良好的A549/DDP細胞，用含10%小牛血清的培養(yǎng)基配成4000個·mL-1細胞懸液，接種在96孔板，每孔接80 μL，同時設空白組，37 ℃培養(yǎng)過夜；分別將新配制的新型吲唑拼接鬼臼毒素化合物二甲基亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物最終濃度分別為5 μmol·L-1， 10 μmol·L-1， 20 μmol·L-1， 40 μmol·L-1和80 μmol·L-1，每組設3復孔；設陽性對照組依托泊苷及順鉑終濃度為5 μmol·L-1， 10 μmol·L-1， 20 μmol·L-1， 40 μmol·L-1和80 μmol·L-1，同時設空白組；細胞培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL MTT的磷酸鹽緩沖液，再 37 ℃下培養(yǎng)4 h，離心5 min除去未轉化的MTT，每孔中加入 150 μL 二甲基亞砜，以溶解還原的MTT 晶體甲臜(formazan)，用酶標儀在568 nm波長測定各孔吸光值OD。細胞增殖抑制率= 1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)，A549/DDP細胞半抑制濃度IC50由spss軟件分析得到。

2.4 分子對接實驗

采用ChemDraw Professional 18.0繪制新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的2D結構，利用Chem 3D 18.0進行3D結構優(yōu)化；然后在PDB(https：//www.rcsb.org)數據庫中檢索并下載微管蛋白秋水仙堿復合物[11-12](PDB：1SA0)的3D圖，利用Py MOL 2.4.0軟件對微管蛋白秋水仙堿復合物進行除水、去除原配體；最后運用AutoDock的可視化軟件進行分子對接。

2.5 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理、統計分析，數據以x±s表示。

3 結 果

3.1 新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的合成結果

新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物：白色固體， 熔點：201.0～201.9 ℃；產率：85.3%；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：8.29(d，J=8.9 Hz， 1H)， 8.09(s， 1H)， 7.89(s， 1H)， 7.65(dd，J=8.9， 1.8 Hz， 1H)， 6.86(s， 1H)， 6.53(s， 1H)， 6.40(s， 2H)， 5.98～5.96(m， 3H)， 4.60(d，J=3.5 Hz， 1H)， 4.47～4.43(m， 1H)， 4.21～4.16(m， 1H)， 3.81(s， 3H)， 3.75(s， 6H)， 3.64～3.58(m， 2H)， 2.94～2.90(m， 4H)；13C NMR(CDCl3， 100 MHz)δ：173.76， 173.03， 171.96， 152.68， 148.18， 147.65， 139.15， 137.87， 137.15， 134.89， 132.80， 132.38， 128.26， 127.86， 123.68， 17.95， 116.76， 109.74， 108.11， 107.13， 101.63， 73.98， 71.44， 60.81， 56.18， 45.57， 43.80， 38.73， 30.29， 28.67；HRMS(ESI-TOF) m/z：Calcd. for C33H29BrNNaO10[M+Na]+：715.0903; Found：715.0905。

3.2 體外抗腫瘤活性測試結果

新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的體外抗腫瘤活性測試結果見表1，該化合物對人非小細胞肺癌細胞(A549)的體外抑制作用不明顯，對人肺腺癌耐順鉑株(A549/DDP)具有細胞毒性[IC50=(82.43±2.35) μM]，且活性明顯優(yōu)于陽性對照藥物順鉑(IC50>100)，同時略優(yōu)于陽性對照藥物依托泊苷[IC50=(84.39±2.69) μM]；與陽性對照藥物依托泊苷和順鉑相比，該化合物表現出對A549/DDP耐藥細胞具有較好的選擇性，RF值<1；對人乳腺癌細胞(MCF-7)細胞株的細胞毒性[IC50=(38.29±2.45)μM]，優(yōu)于陽性對照藥物順鉑[IC50=(54.72±1.37) μM]，弱于陽性對照藥物依托泊苷[IC50=(13.18±0.55)μM]。

表1 新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的體外抗腫瘤活性測試結果

3.3 分子對接實驗結果

新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物丁二酸側鏈1位酯基與微管蛋白秋水仙堿作用位點的ASN-101氨基酸殘基形成氫鍵(d= 2.3 ?)，對接的結合能(affinity)為 -11.2 kcal/mol，表示化合物新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物與微管蛋白能夠進行較好的結合，其抗腫瘤機制可能是作用于微管蛋白，影響有絲分裂過程，從而影響其細胞分裂過程而走向凋亡。

圖3 新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物與微管蛋白秋水仙堿作用位點(PDB：1SA0)分子對接圖

4 結 論

新型吲唑拼接鬼臼毒素衍生物的合成方法簡便、產率高，該化合物對人肺腺癌耐順鉑株(A549/DDP)具有較好的選擇性，且細胞毒性明顯優(yōu)于陽性對照藥物順鉑，同時略優(yōu)于陽性對照藥物依托泊苷；對人乳腺癌細胞(MCF-7)細胞株的細胞毒性，優(yōu)于陽性對照藥物順鉑，分子對接結果顯示該化合物與微管蛋白秋水仙堿作用位點的ASN-101氨基酸殘基與形成氫鍵(d=2.3 ?)，結合能(affinity)為 -11.2 kcal/mol，能夠較好的結合，其作用機制可能是作用于微管蛋白，影響有絲分裂過程，從而影響其細胞分裂過程而走向凋亡，有待進一步實驗驗證，該化合物對研究活性骨架拼接及抗腫瘤耐藥藥物研發(fā)具有一定的意義。