陳清艷

（上海旺旺食品集團有限公司，上海 201103）

0 引言

雙歧桿菌是人體和部分動物腸道內(nèi)重要的組成部分，具有調(diào)整腸道功能及改善營養(yǎng)的作用、抗過敏、抗腫瘤和控制葡萄糖代謝等益生功能[1-9]。目前食品中可添加的雙歧桿菌種類、菌株及產(chǎn)品形式呈多樣化，雙歧桿菌對營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件較為苛刻，其生長特性存在差異[10-12]，因此針對不同產(chǎn)品中雙歧桿菌計數(shù)時，國標方法計數(shù)結(jié)果跟理論值存在較大差異。雙歧桿菌活菌數(shù)量是評價產(chǎn)品功能性的關(guān)鍵指標，生產(chǎn)者有必要深入研究其培養(yǎng)條件，盡可能準確地證實其產(chǎn)品中雙歧桿菌活菌的實際水平。本實驗以乳雙歧桿菌BB12和長雙歧桿菌BB536益生菌錠片為樣品，比較了MRS、半胱氨酸鹽酸鹽+MRS、雙歧桿菌計數(shù)瓊脂BBL 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果，以選擇最適合的培養(yǎng)基對益生菌產(chǎn)品中雙歧桿菌進行計數(shù)實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS(ManRogosaS harpe)培養(yǎng)基、雙歧桿菌計數(shù)瓊脂BBL培養(yǎng)基、半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸鹽緩沖液、西紅柿浸出液，北京陸橋；乳雙歧桿菌BB12錠片、長雙歧桿菌BB536錠片，本實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

電磁加熱攪拌器SLR，德國SCHOTT；高溫高壓滅菌釜MLS-3751L-PC，日本松下；拍擊式均質(zhì)器bagmixer 400vw、BagPipet移液器，法國Interscience；旋渦振蕩器，德國IKA；雙人垂直超凈工作臺CDA-1650-1，上海上凈；AW 200SG厭氧工作站，英國ELECTROTEK；50i生物顯微鏡，NIKON。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品稀釋

無菌操作稱取樣品25 g，加入225 mL的無菌磷酸鹽緩沖液中，拍擊式均質(zhì)2 min，充分振搖混合均勻，制成10-1稀釋度的樣液；吸取10-1稀釋度樣液1 mL，加入9 mL無菌磷酸鹽緩沖液中，旋渦振蕩制成10-2稀釋度；依次操作，制成目標稀釋度。

1.3.2 接種

根據(jù)樣品益生菌添加量預(yù)估其可能雙歧桿菌含量，選擇3個合適稀釋度的樣液接種，每種培養(yǎng)基每個稀釋度分別接種2個平皿，每皿加樣1 mL，故每個稀釋度樣液分別接6個平皿，其中2個平皿傾注MRS培養(yǎng)基；2個平皿傾注半胱氨酸鹽酸鹽+MRS培養(yǎng)基，2個平皿傾注BBL培養(yǎng)基。

1.3.3 培養(yǎng)

待瓊脂凝固后，將平板倒置于厭氧工作站，36±1℃培養(yǎng)72±2 h。

1.3.4 菌落觀察計數(shù)

選取菌落數(shù)在30~300 CFU內(nèi)的平板計數(shù)。

1.3.5 涂片鏡檢

觀察細胞形態(tài)和純度（是否有雜菌），雙歧桿菌為革蘭氏陽性，無芽胞，桿狀；乳雙歧桿菌BB12呈短桿狀，有時候一端呈匙狀，單個或成對；長雙歧桿菌BB536呈細長桿狀，有時候一端或兩端分叉。

1.3.6 菌落數(shù)計算

依GB 4789.35 6.4計算每g樣品中雙歧桿菌菌落數(shù)[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 計數(shù)結(jié)果比較分析

添加乳雙歧桿菌BB12的益生菌錠片樣品，MRS、半胱氨酸鹽酸鹽+MRS（以下簡寫為CYSMRS）、BBL 3種培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果如下表1，BBL計數(shù)結(jié)果較MRS、CYS-MRS高，CYS-MRS培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果普遍高于MRS；BBL平板的上的菌落較小，需要借助菌落計數(shù)器觀察計數(shù)，MRS、CYSMRS平板上的菌落較大，肉眼即可觀察計數(shù)，如圖1所示。

圖1 乳雙歧桿菌BB12培養(yǎng)情況

表1 3種培養(yǎng)基對BB12錠片樣品中雙歧桿菌計數(shù)結(jié)果

對表1計數(shù)結(jié)果進行分析，MRS與CYS-MRS培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），MRS與BBL、CYS-MRS與BBL培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果差異顯著（P＜0.05）。

對添加長雙歧桿菌BB536的益生菌錠片樣品，MRS、CYS-MRS、BBL 3種培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果如表2。3種培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果差異不明顯，菌落生長情況同BB12，BBL平板上菌落較小，MRS、CYS-MRS平板上菌落較大。

表2 3種培養(yǎng)基對BB536錠片樣品中雙歧桿菌計數(shù)結(jié)果

（續(xù)表2）

對表2計數(shù)結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，MRS、CYSMRS和BBL 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 細胞形態(tài)觀察結(jié)果

革蘭氏染色后，在物鏡100×油鏡，15×目鏡條件下鏡檢。乳雙歧桿菌BB12細胞呈革蘭氏陽性，棒狀，有時候一端呈匙狀，單個或成對排列如圖2。長雙歧桿菌BB536的細胞呈細長桿狀，一端有時呈匙狀，有時一端或兩端呈分叉狀，單個排列，如圖3。形態(tài)隨培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基可能有變化。

圖2 乳雙歧桿菌BB12的細胞形態(tài)

圖3 長雙歧桿菌BB536的細胞形態(tài)

3 結(jié)論

根據(jù)56個添加雙歧桿菌的益生菌錠片樣品中雙歧桿菌測定結(jié)果看，添加乳雙歧桿菌桿菌BB12的錠片樣品，MRS、半胱胺酸鹽酸鹽+MRS、BBL 3種培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果差異較顯著，BBL計數(shù)結(jié)果最高，其次是半胱氨酸鹽酸鹽+MRS，MRS培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果最低；對于添加長雙歧桿菌BB536的益生菌錠片樣品，上述3種培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果差異不顯著。BB536錠片樣品種雙歧桿菌計數(shù)結(jié)果與預(yù)估添加菌量相近；BB12墊片樣品中雙歧桿菌計數(shù)結(jié)果較預(yù)估添加菌量低了約3個log/g，可能錠片加工工藝對該菌株活性損傷較大所致。

為了準確對雙歧桿菌檢驗計數(shù)，很多實驗室針對不同產(chǎn)品基質(zhì)、不同稀釋液、培養(yǎng)方式、鑒定方法等已經(jīng)進行大量研究?，F(xiàn)行標準方法有：（1）GB 4789.35[13]適用范圍為食品樣品，雙歧桿菌計數(shù)培養(yǎng)基為添加莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的改良MRS，莫匹羅星鋰鹽能夠抑制乳桿菌的生長而不抑制雙歧桿菌的生長，L-半胱氨酸能夠提供雙歧桿菌生長的還原性環(huán)境，促進雙歧桿菌生長[14]；（2）GB 4789.34[15]適用范圍是產(chǎn)品中僅含有雙歧桿菌屬的樣品，培養(yǎng)基為雙歧桿菌計數(shù)瓊脂BBL或MRS瓊脂培養(yǎng)基；（3）QB/T 4575[16]食品加工用乳酸菌中A.4對于單純的雙歧桿菌的檢測，采用MRS或TOS培養(yǎng)基。在200 mL培養(yǎng)基中加入2 mL濃度為5%的鹽酸半胱氨酸溶液（每次使用前配制）。

根據(jù)以上標準方法，對僅含有雙歧桿菌屬的樣品進行雙歧桿菌培養(yǎng)計數(shù)時，可以選擇半胱氨酸鹽酸鹽+MRS、雙歧桿菌計數(shù)培養(yǎng)基BBL、MRS培養(yǎng)基或TOS培養(yǎng)基。

另外，樣品溶解用稀釋液的選擇，對雙歧桿菌的計數(shù)結(jié)果可能也有影響。王似錦等[14]比較了生理鹽水（NS）、林格液（QSR液）、磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）、半胱氨酸磷酸鹽緩沖液(CYS緩沖液)4種稀釋液進行雙歧桿菌計數(shù)的結(jié)果差異，發(fā)現(xiàn)CYS緩沖液作為稀釋液時計數(shù)結(jié)果最高，討論可能因CYS緩沖液中的L-半胱氨酸鹽酸鹽具有還原性，可以為雙歧桿菌生長提供一定的厭氧環(huán)境，并且CYS緩沖液含有吐溫80能使雙歧桿菌更充分的釋放和分散均勻。因此，有必要進行稀釋液比對實驗，根據(jù)產(chǎn)品特性及產(chǎn)品中添加的雙歧桿菌的菌種及菌株不同，以針對性地選擇最佳稀釋液，從而有利于提高雙歧桿菌的檢出率，準確計數(shù)。后續(xù)將進一步進行稀釋液比對實驗，及稀釋液與培養(yǎng)基組合比對實驗，以確認該兩種雙歧桿菌產(chǎn)品的最優(yōu)稀釋液和培養(yǎng)基。

依實驗數(shù)據(jù)看，相同工藝生產(chǎn)的雙歧桿菌益生菌產(chǎn)品，若所含的雙歧桿菌的菌種不同，不同培養(yǎng)基進行培養(yǎng)計數(shù)，結(jié)果可能存在差異。要對產(chǎn)品中雙歧桿菌準確計數(shù)定量，則有必要對雙歧桿菌計數(shù)的多種培養(yǎng)基進行比對實驗，選擇最優(yōu)培養(yǎng)基用于雙歧桿菌的培養(yǎng)計數(shù)，使結(jié)果更精準，為益生菌產(chǎn)品開發(fā)階段評價原料及產(chǎn)品中雙歧桿菌的含量及益生菌產(chǎn)品在儲存期間雙歧桿菌的穩(wěn)定性、工藝及配方的改進提供可靠的參考數(shù)據(jù)。