陳清艷

（上海旺旺食品集團(tuán)有限公司，上海 201103）

0 引言

雙歧桿菌是人體和部分動(dòng)物腸道內(nèi)重要的組成部分，具有調(diào)整腸道功能及改善營(yíng)養(yǎng)的作用、抗過(guò)敏、抗腫瘤和控制葡萄糖代謝等益生功能[1-9]。目前食品中可添加的雙歧桿菌種類、菌株及產(chǎn)品形式呈多樣化，雙歧桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件較為苛刻，其生長(zhǎng)特性存在差異[10-12]，因此針對(duì)不同產(chǎn)品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)時(shí)，國(guó)標(biāo)方法計(jì)數(shù)結(jié)果跟理論值存在較大差異。雙歧桿菌活菌數(shù)量是評(píng)價(jià)產(chǎn)品功能性的關(guān)鍵指標(biāo)，生產(chǎn)者有必要深入研究其培養(yǎng)條件，盡可能準(zhǔn)確地證實(shí)其產(chǎn)品中雙歧桿菌活菌的實(shí)際水平。本實(shí)驗(yàn)以乳雙歧桿菌BB12和長(zhǎng)雙歧桿菌BB536益生菌錠片為樣品，比較了MRS、半胱氨酸鹽酸鹽+MRS、雙歧桿菌計(jì)數(shù)瓊脂BBL 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果，以選擇最適合的培養(yǎng)基對(duì)益生菌產(chǎn)品中雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS(ManRogosaS harpe)培養(yǎng)基、雙歧桿菌計(jì)數(shù)瓊脂BBL培養(yǎng)基、半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸鹽緩沖液、西紅柿浸出液，北京陸橋；乳雙歧桿菌BB12錠片、長(zhǎng)雙歧桿菌BB536錠片，本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

電磁加熱攪拌器SLR，德國(guó)SCHOTT；高溫高壓滅菌釜MLS-3751L-PC，日本松下；拍擊式均質(zhì)器bagmixer 400vw、BagPipet移液器，法國(guó)Interscience；旋渦振蕩器，德國(guó)IKA；雙人垂直超凈工作臺(tái)CDA-1650-1，上海上凈；AW 200SG厭氧工作站，英國(guó)ELECTROTEK；50i生物顯微鏡，NIKON。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品稀釋

無(wú)菌操作稱取樣品25 g，加入225 mL的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中，拍擊式均質(zhì)2 min，充分振搖混合均勻，制成10-1稀釋度的樣液；吸取10-1稀釋度樣液1 mL，加入9 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中，旋渦振蕩制成10-2稀釋度；依次操作，制成目標(biāo)稀釋度。

1.3.2 接種

根據(jù)樣品益生菌添加量預(yù)估其可能雙歧桿菌含量，選擇3個(gè)合適稀釋度的樣液接種，每種培養(yǎng)基每個(gè)稀釋度分別接種2個(gè)平皿，每皿加樣1 mL，故每個(gè)稀釋度樣液分別接6個(gè)平皿，其中2個(gè)平皿傾注MRS培養(yǎng)基；2個(gè)平皿傾注半胱氨酸鹽酸鹽+MRS培養(yǎng)基，2個(gè)平皿傾注BBL培養(yǎng)基。

1.3.3 培養(yǎng)

待瓊脂凝固后，將平板倒置于厭氧工作站，36±1℃培養(yǎng)72±2 h。

1.3.4 菌落觀察計(jì)數(shù)

選取菌落數(shù)在30~300 CFU內(nèi)的平板計(jì)數(shù)。

1.3.5 涂片鏡檢

觀察細(xì)胞形態(tài)和純度（是否有雜菌），雙歧桿菌為革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)芽胞，桿狀；乳雙歧桿菌BB12呈短桿狀，有時(shí)候一端呈匙狀，單個(gè)或成對(duì)；長(zhǎng)雙歧桿菌BB536呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，有時(shí)候一端或兩端分叉。

1.3.6 菌落數(shù)計(jì)算

依GB 4789.35 6.4計(jì)算每g樣品中雙歧桿菌菌落數(shù)[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 計(jì)數(shù)結(jié)果比較分析

添加乳雙歧桿菌BB12的益生菌錠片樣品，MRS、半胱氨酸鹽酸鹽+MRS（以下簡(jiǎn)寫為CYSMRS）、BBL 3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果如下表1，BBL計(jì)數(shù)結(jié)果較MRS、CYS-MRS高，CYS-MRS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果普遍高于MRS；BBL平板的上的菌落較小，需要借助菌落計(jì)數(shù)器觀察計(jì)數(shù)，MRS、CYSMRS平板上的菌落較大，肉眼即可觀察計(jì)數(shù)，如圖1所示。

圖1 乳雙歧桿菌BB12培養(yǎng)情況

表1 3種培養(yǎng)基對(duì)BB12錠片樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果

對(duì)表1計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析，MRS與CYS-MRS培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05），MRS與BBL、CYS-MRS與BBL培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果差異顯著（P＜0.05）。

對(duì)添加長(zhǎng)雙歧桿菌BB536的益生菌錠片樣品，MRS、CYS-MRS、BBL 3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果如表2。3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果差異不明顯，菌落生長(zhǎng)情況同BB12，BBL平板上菌落較小，MRS、CYS-MRS平板上菌落較大。

表2 3種培養(yǎng)基對(duì)BB536錠片樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果

（續(xù)表2）

對(duì)表2計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，MRS、CYSMRS和BBL 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

革蘭氏染色后，在物鏡100×油鏡，15×目鏡條件下鏡檢。乳雙歧桿菌BB12細(xì)胞呈革蘭氏陽(yáng)性，棒狀，有時(shí)候一端呈匙狀，單個(gè)或成對(duì)排列如圖2。長(zhǎng)雙歧桿菌BB536的細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，一端有時(shí)呈匙狀，有時(shí)一端或兩端呈分叉狀，單個(gè)排列，如圖3。形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基可能有變化。

圖2 乳雙歧桿菌BB12的細(xì)胞形態(tài)

圖3 長(zhǎng)雙歧桿菌BB536的細(xì)胞形態(tài)

3 結(jié)論

根據(jù)56個(gè)添加雙歧桿菌的益生菌錠片樣品中雙歧桿菌測(cè)定結(jié)果看，添加乳雙歧桿菌桿菌BB12的錠片樣品，MRS、半胱胺酸鹽酸鹽+MRS、BBL 3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果差異較顯著，BBL計(jì)數(shù)結(jié)果最高，其次是半胱氨酸鹽酸鹽+MRS，MRS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果最低；對(duì)于添加長(zhǎng)雙歧桿菌BB536的益生菌錠片樣品，上述3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果差異不顯著。BB536錠片樣品種雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果與預(yù)估添加菌量相近；BB12墊片樣品中雙歧桿菌計(jì)數(shù)結(jié)果較預(yù)估添加菌量低了約3個(gè)log/g，可能錠片加工工藝對(duì)該菌株活性損傷較大所致。

為了準(zhǔn)確對(duì)雙歧桿菌檢驗(yàn)計(jì)數(shù)，很多實(shí)驗(yàn)室針對(duì)不同產(chǎn)品基質(zhì)、不同稀釋液、培養(yǎng)方式、鑒定方法等已經(jīng)進(jìn)行大量研究?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法有：（1）GB 4789.35[13]適用范圍為食品樣品，雙歧桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為添加莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的改良MRS，莫匹羅星鋰鹽能夠抑制乳桿菌的生長(zhǎng)而不抑制雙歧桿菌的生長(zhǎng)，L-半胱氨酸能夠提供雙歧桿菌生長(zhǎng)的還原性環(huán)境，促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)[14]；（2）GB 4789.34[15]適用范圍是產(chǎn)品中僅含有雙歧桿菌屬的樣品，培養(yǎng)基為雙歧桿菌計(jì)數(shù)瓊脂BBL或MRS瓊脂培養(yǎng)基；（3）QB/T 4575[16]食品加工用乳酸菌中A.4對(duì)于單純的雙歧桿菌的檢測(cè)，采用MRS或TOS培養(yǎng)基。在200 mL培養(yǎng)基中加入2 mL濃度為5%的鹽酸半胱氨酸溶液（每次使用前配制）。

根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)僅含有雙歧桿菌屬的樣品進(jìn)行雙歧桿菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，可以選擇半胱氨酸鹽酸鹽+MRS、雙歧桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基BBL、MRS培養(yǎng)基或TOS培養(yǎng)基。

另外，樣品溶解用稀釋液的選擇，對(duì)雙歧桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果可能也有影響。王似錦等[14]比較了生理鹽水（NS）、林格液（QSR液）、磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）、半胱氨酸磷酸鹽緩沖液(CYS緩沖液)4種稀釋液進(jìn)行雙歧桿菌計(jì)數(shù)的結(jié)果差異，發(fā)現(xiàn)CYS緩沖液作為稀釋液時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果最高，討論可能因CYS緩沖液中的L-半胱氨酸鹽酸鹽具有還原性，可以為雙歧桿菌生長(zhǎng)提供一定的厭氧環(huán)境，并且CYS緩沖液含有吐溫80能使雙歧桿菌更充分的釋放和分散均勻。因此，有必要進(jìn)行稀釋液比對(duì)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)產(chǎn)品特性及產(chǎn)品中添加的雙歧桿菌的菌種及菌株不同，以針對(duì)性地選擇最佳稀釋液，從而有利于提高雙歧桿菌的檢出率，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行稀釋液比對(duì)實(shí)驗(yàn)，及稀釋液與培養(yǎng)基組合比對(duì)實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)該兩種雙歧桿菌產(chǎn)品的最優(yōu)稀釋液和培養(yǎng)基。

依實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，相同工藝生產(chǎn)的雙歧桿菌益生菌產(chǎn)品，若所含的雙歧桿菌的菌種不同，不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，結(jié)果可能存在差異。要對(duì)產(chǎn)品中雙歧桿菌準(zhǔn)確計(jì)數(shù)定量，則有必要對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)的多種培養(yǎng)基進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)培養(yǎng)基用于雙歧桿菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)，使結(jié)果更精準(zhǔn)，為益生菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)階段評(píng)價(jià)原料及產(chǎn)品中雙歧桿菌的含量及益生菌產(chǎn)品在儲(chǔ)存期間雙歧桿菌的穩(wěn)定性、工藝及配方的改進(jìn)提供可靠的參考數(shù)據(jù)。