劉 玲，蔣婷婷，楊宇龍，施曉艷，劉雅蓉，吳鴻飛，戴 敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽 合肥 230012)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿AS發(fā)展的始終[1]，巨噬細(xì)胞通過清道夫受體CD36攝取氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞分泌炎癥因子加劇AS的發(fā)生與發(fā)展[2]。AS炎癥的發(fā)生與多種微小RNA(micro RNA，miRNA)有關(guān)，miR-145在巨噬細(xì)胞上均有分布，且在AS斑塊中低表達(dá)[3]。在病理情況下，它的下游靶基因CD40在巨噬細(xì)胞上高度表達(dá)，與受體結(jié)合后可以激活下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路，導(dǎo)致炎癥因子白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)的釋放[4-5]。

丹皮酚(paeonol，Pae)為毛茛科植物牡丹PaeoniaSuffruticoasAndr.干燥根皮的主要活性成分之一，具有抗炎、抗AS作用[67]。但是Pae抗泡沫細(xì)胞炎癥作用機(jī)制尚不清楚。本課題組采用高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠復(fù)制AS模型，從整體動物水平觀察Pae對主動脈miR-145表達(dá)的影響及其抑制血管泡沫細(xì)胞炎癥的作用；進(jìn)一步采用ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞炎癥模型，從細(xì)胞水平探討Pae是否通過影響miR-145的表達(dá)，抑制CD40/NF-κB通路，從而發(fā)揮抑制泡沫細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康雄性ApoE-/-和C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量為(20±5)g，7～8周齡，常州卡文實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2019-0001，實驗動物在(21±1)℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間給予高脂飼料。

1.2 RAW264.7細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素)，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下，每隔1 d傳代一次。

1.3 藥物與試劑 Pae(批號T2012218，純度99%)：宣城百草藥業(yè)有限公司；ox-LDL(批號1805P210642)：上海懋康生物科技有限公司；油紅O染色液(批號20201113)：北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞分化抗原40(clusters of differentitation 40，CD40)、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(p-NF-κB p65，p-p65)(批號C69G12、C74G24)：美國Cell Signaling Technology公司；CD36(批號18426685)：Santa Cruz Biotechnology；Lipofectamine?2000試劑(批號2267372)：美國Invitrogen生命技術(shù)公司；IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(批號JL20050002、JL20040001、JL20050001)：美國酶免公司。

1.4 儀器 電子精密分析天平：上海精密科學(xué)儀器公司；熒光顯微鏡：日本Olympus公司；石蠟切片機(jī)：德國Leica公司；移液槍：美國Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀：美國MD公司；低溫臺式離心機(jī)：美國Thermo公司；實時熒光定量PCR檢測儀(M×3000P)：Agilent Technologies Stratagene。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組：模型組和Pae中、高劑量組，每組6只，給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方為20%蛋白質(zhì)、50%碳水化合物、21%脂肪、0.15%膽固醇。另取6只C57BL/6J小鼠為空白組，普通飼料喂養(yǎng)。Pae組灌胃給予Pae溶液(200、300 mg/kg)，其余兩組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，給藥容積均為10 mL/kg。

2.2 油紅O染色觀察主動脈病理學(xué)變化 第20周末，動物禁食、處死，預(yù)冷PBS沖洗小鼠心臟及主動脈血管組織，使用纖維剪將心臟去除，在體式顯微鏡下觀察，用顯微鑷及顯微剪將血管外膜上附著的脂肪及其他組織分離去除，用顯微剪將血管縱向剖開。平鋪整根主動脈，用細(xì)針將其固定于黑色培養(yǎng)皿上，油紅O工作液染15 min，分別用100%和65%異丙醇分化5 min，采用高分辨率相機(jī)拍照，以斑塊占總血管面積的百分比代表AS的相對嚴(yán)重程度。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀測主動脈免疫熒光蛋白CD36、CD40 采用免疫熒光雙染CD36與CD40蛋白，即紅色熒光與綠色熒光共定位的紅色熒光部分占綠色熒光區(qū)域面積的系數(shù)，以此檢測并比較各組主動脈巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中CD40的表達(dá)水平。將預(yù)先放入-80 ℃的主動脈病理切片，放置室溫復(fù)溫，加入4%多聚甲醛固定30 min，使用0.1% TritonX-100通化細(xì)胞，加入5%羊血清浸潤封閉后按照說明書分別加入相應(yīng)的特異性一抗、二抗；37 ℃恒溫箱中孵育1 h取出后，加入DAPI在室溫下孵育10 min，對細(xì)胞核進(jìn)行染色，加入防猝滅劑，在激光共聚焦顯微鏡下觀察兩種蛋白染色情況并拍照。

2.4 RT-PCR檢測miR-145表達(dá)水平 50 ～100 mg主動脈或培養(yǎng)板中每孔加入1 mL的Trizol，用移液槍反復(fù)吹打80次，移入無酶的1.5 mL的EP管中，室溫靜置5 min，每管加入200 μL的氯仿，劇烈搖15 s，12 000 r/min離心15 min，取EP管中最上層，加入等容積的氯仿， 10 000 r/min離心10 min，加入75%乙醇，10 000 r/min離心10 min，棄上清，用濾紙吸干殘余液體，加20 μL DEPC水溶解白色沉淀。測定RNA濃度后，按照SYBR Green PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR。miR-145上游引物是5′-CGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′，下游引物是5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′，U6上游引物是5′-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物是5′-ATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′，采用2-ΔΔCT法計算miR-145表達(dá)水平。

2.5 ELISA法檢測IL-1、IL-6、TNF-α水平 將小鼠麻醉后暴露腹腔，定位腹主動脈并取血，4 000 r/min離心15 min，分離上層血清，EP管分裝或?qū)AW264.7細(xì)胞懸液接種于6孔板中，進(jìn)行分組后，收集各組細(xì)胞的上清液，采用ELISA法，在450 nm波長下測量各孔的A值，計算血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 RAW264.7細(xì)胞用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每隔1 d更換新鮮的培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，用胰酶消化，進(jìn)行后續(xù)實驗。

將RAW264.7(1×105/mL)接種于6孔板中，每孔含有2 mL培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，根據(jù)Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-145模擬劑和miR-145抑制劑轉(zhuǎn)染入細(xì)胞12 h后，給予Pae預(yù)保護(hù)24 h，更換含ox-LDL的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，備用。等到RAW264.7融合度約達(dá)到80%時，終止細(xì)胞培養(yǎng)，用細(xì)胞刮輕輕地刮取細(xì)胞，以提取RAW264.7的總蛋白，將實驗分成7組。①空白組；②模型組：加入ox-LDL(80 μg/mL)；③Pae組：加Pae(60 μmol/L)；④miR-145模擬劑組：轉(zhuǎn)染miR-145模擬劑后，加ox-LDL；⑤miR-145抑制劑組：轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后，加ox-LDL；⑥Pae+miR-145模擬劑組：轉(zhuǎn)染miR-145模擬劑后，再加入Pae和ox-LDL；⑦Pae+miR-145抑制劑組：轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后，加Pae和ox-LDL；每組設(shè)3個復(fù)孔。

2.7 細(xì)胞毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)檢測細(xì)胞毒性 將RAW264.7細(xì)胞混懸液(1×105/mL)接種于96孔板中培養(yǎng)，加入含有不同濃度(10、20、40、80、160 μmol/L)的ox-LDL培養(yǎng)液100 μL的細(xì)胞為實驗組，另設(shè)不含ox-LDL刺激劑的培養(yǎng)液的細(xì)胞為正常對照組，只有培養(yǎng)液的為空白組，分別在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，CCK8法檢測細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞存活率=(A實驗組-A空白組)/A正常對照組×100%。得到ox-LDL刺激RAW264.7細(xì)胞的最佳濃度。

每孔預(yù)先給予含不同濃度(15、30、60、120、240 μmol/L)Pae的培養(yǎng)液100 μL，分別置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱12 h，采用CCK-8法測定A值。細(xì)胞存活率=(A實驗組-A空白組)/(A正常對照組-A空白組)×100%。得出Pae保護(hù)RAW264.7細(xì)胞的最佳濃度。

2.8 油紅O觀察細(xì)胞的荷脂情況 用異丙醇配置5%油紅O儲備液備用，細(xì)胞用PBS洗2次，4%的多聚甲醛固定30 min，油紅O儲備液經(jīng)濾紙過濾后與去離子水按3∶2比例稀釋成工作液，染色30 min，用PBS清洗，顯微鏡下觀察脂質(zhì)蓄積情況。

2.9 Western blot法檢測CD40和p-p65水平 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，加上適量的裂解液，冰上裂解30 min，離心棄去上清液，加入上樣緩沖液后高溫使蛋白變性，提取各組細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說明書計算蛋白濃度，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別與特異性一抗、二抗孵育，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光，用Image J軟件分析目的蛋白灰度值，分析CD40、p-p65蛋白水平。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)運(yùn)用Graph Pad Prism 8軟件分析處理，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Pae對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響 與空白組比較，模型組小鼠主動脈及主動脈弓處陽性區(qū)斑塊面積顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠主動脈及主動脈弓處陽性區(qū)斑塊面積顯著減少(P<0.05)。見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae中劑量組；D.Pae高劑量組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 Pae對AS小鼠主動脈CD36、CD40蛋白共定位的影響 與空白組比較，模型組小鼠主動脈泡沫細(xì)胞共定位系數(shù)增大(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠主動脈泡沫細(xì)胞共定位系數(shù)顯著減小(P<0.05)，說明Pae顯著下調(diào)主動脈泡沫細(xì)胞上CD40蛋白表達(dá)水平。見圖2、圖3。

圖2 CD36、CD40表達(dá)的免疫熒光圖(免疫熒光染色法，10×20倍)

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae中劑量組；D.Pae高劑量組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 Pae對ApoE-/-小鼠主動脈miR-145表達(dá)水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠主動脈miR-145表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠主動脈miR-145表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，說明Pae可以上調(diào)AS主動脈miR-145表達(dá)水平。見圖4。

圖4 Pae對ApoE-/-小鼠主動脈miR-145表達(dá)的影響

3.4 Pae對ApoE-/-小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，Pae中、高劑量組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，說明Pae能降低AS小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。見圖5。

圖5 Pae對ApoE-/-小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的影響

3.5 ox-LDL對巨噬細(xì)胞活力及脂質(zhì)蓄積的影響 與空白組比較，ox-LDL 80、160 mg/L時細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，本實驗以80 mg/L ox-LDL開展后續(xù)實驗。顯微鏡下油紅O染色顯示：經(jīng)過ox-LDL(80 mg/L)干預(yù)24 h后的巨噬細(xì)胞，在油紅O染色中細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴，表明巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞建立成功。見圖6。

注：A.空白組；B.10 mg/L ox-LDL組；C.20 mg/L ox-LDL組；D.40 mg/L ox-LDL組；E.80 mg/L ox-LDL組；F.160 mg/L ox-LDL組；與空白組比較，*P<0.05

3.6 Pae對巨噬源性泡沫細(xì)胞的保護(hù)作用 與空白組比較，模型組(ox-LDL 80 mg/L)細(xì)胞的活力顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，Pae(15、30、60、120、240 μmol/L)對細(xì)胞有不同程度的保護(hù)作用(P<0.05)，且在60 μmol/L對ox-LDL損傷的巨噬細(xì)胞保護(hù)作用最好，故后續(xù)實驗采用此濃度。見圖7。

注：A.空白組；B.模型組；C.15 μmol/L Pae組；D.30 μmol/L Pae組；E.60 μmol/L Pae組；F.120 μmol/L Pae組；G.240 μmol/L Pae組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.7 Pae對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞表達(dá)miR-145的影響 與空白組比較，模型組miR-145水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，Pae組miR-145水平顯著上調(diào)(P<0.05)，表明Pae可以上調(diào)泡沫細(xì)胞表達(dá)miR-145水平。見圖8。

圖8 Pae對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞表達(dá)miR-145的影響

3.8 Pae對轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞表達(dá)CD40、p-p65蛋白的影響 與空白組比較，模型組CD40、p-p65蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，Pae組CD40、p-p65蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與Pae組比較，Pae+miR-145模擬劑組CD40、p-p65蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果提示Pae通過上調(diào)miR-145水平抑制泡沫細(xì)胞CD40、p-p65蛋白的表達(dá)。見圖9。

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae組；D.ox-LDL+Pae組；E.ox-LDL+Pae+miR-145抑制劑組；F.ox-LDL+miR-145模擬制組；G.ox-LDL+Pae+miR-145模擬劑組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與Pae組比較，△P<0.05

3.9 Pae對轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6水平的影響 與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，Pae組TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與Pae組比較，Pae+miR-145模擬劑組TNF-α、IL-1、IL-6水平顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果提示Pae通過上調(diào)miR-145水平抑制泡沫細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá)。見圖10。

注：A.空白組；B.模型組；C.Pae組；D.ox-LDL+Pae+miR-145模擬劑組；E.ox-LDL+Pae+miR-145抑制劑組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與Pae組比較，△P<0.05

4 討論

AS不僅是一種脂質(zhì)代謝紊亂引起的代謝性疾病[8]，而且還是一種慢性血管炎癥性疾病，當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時，體內(nèi)炎癥因子和黏附分子增加，單核細(xì)胞在各種因子的驅(qū)動下，通過受體介導(dǎo)的方式遷移出血管進(jìn)入各組織器官，分化為巨噬細(xì)胞[9]。巨噬細(xì)胞通過表面清道夫受體CD36吞噬ox-LDL，轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[10]，形成早期的AS斑塊，且泡沫細(xì)胞分泌的炎癥因子和趨化因子促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附、浸潤以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終導(dǎo)致斑塊的破裂。斑塊破裂又是導(dǎo)致心腦血管突發(fā)意外的重要原因[11]。有研究[12]表明，CD36-/-小鼠巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL的能力下降，以至于泡沫細(xì)胞形成減少，從而導(dǎo)致由泡沫細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)減小，延緩AS的進(jìn)展。

AS炎癥的發(fā)生與多種miRNA有關(guān)，miR-145在多種細(xì)胞中表達(dá)，這其中包括巨噬細(xì)胞，miR-145的表達(dá)水平可以用來預(yù)測心血管疾病患者冠狀動脈病變的存在及嚴(yán)重程度[13]。本研究結(jié)果表明，AS小鼠主動脈miR-145水平降低，炎癥因子升高，而給予Pae后，miR-145升高，炎癥因子降低；進(jìn)一步研究miR-145模擬劑、miR-145抑制劑轉(zhuǎn)染泡沫細(xì)胞后miR-145與各種炎癥因子表達(dá)變化的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-145模擬劑后，miR-145表達(dá)上調(diào)，炎癥因子水平下降，轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后，miR-145表達(dá)下調(diào)，炎癥因子水平上升。因此Pae抑制炎癥的作用可能與上調(diào)miR-145的表達(dá)有關(guān)。

CD40是miR-145的靶基因，受miR-145的調(diào)控[14]。在生理情況下，巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膜蛋白CD40是低表達(dá)或不表達(dá)的，當(dāng)遇到炎癥等刺激時其表達(dá)量上調(diào)，CD40受體與其配體結(jié)合后，激活CD40受體，導(dǎo)致NF-κB活化易位，誘導(dǎo)炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的分泌[15]。本研究轉(zhuǎn)染miR-145模擬劑泡沫細(xì)胞后結(jié)果顯示，CD40蛋白及其下游p-p65蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，與Pae干預(yù)后miR-145表達(dá)水平上調(diào)、CD40蛋白及其下游p-p65蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)結(jié)果一致。轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后，Pae具有逆轉(zhuǎn)miR-145表達(dá)下調(diào)，CD40蛋白、p-p65蛋白表達(dá)上調(diào)的作用。因此，Pae可能通過上調(diào)miR-145的表達(dá)抑制CD40蛋白及其下游p-p65蛋白的表達(dá)，抑制炎癥因子的分泌，減輕泡沫細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，Pae對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分泌的炎癥因子具有顯著的抑制作用，該抑制作用可能與Pae上調(diào)miR-145的表達(dá)從而抑制炎癥通路CD40/NF-κB有關(guān)，該研究結(jié)果為Pae抗AS作用的分子機(jī)制提供了實驗證據(jù)。