余用秀，葛永怡，譚玉梅，王亞萍，邵 蕾，劉作易

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；3.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550006；4.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550006)

0 引言

冠突曲霉(Aspergilluscristatus)是茯茶上的優(yōu)勢(shì)菌，又名“金花菌”?！敖鸹ň钡亩嗌俪１挥脕?lái)判斷茯磚茶的品質(zhì)[1]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，低滲條件下，該菌以有性發(fā)育為主；在高滲條件下，冠突曲霉以無(wú)性發(fā)育為主，并產(chǎn)生純的無(wú)性孢子[2]。因此，冠突曲霉是研究絲狀真菌產(chǎn)孢機(jī)制的好材料。

絲狀真菌的無(wú)性產(chǎn)孢是其進(jìn)行繁殖的常見(jiàn)方式之一，在發(fā)育過(guò)程中受到了多個(gè)基因的精密調(diào)控。據(jù)報(bào)道，在模式菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，brlA、abaA和wetA組成調(diào)控構(gòu)巢曲霉無(wú)性發(fā)育的中心調(diào)控途徑，并決定無(wú)性產(chǎn)孢過(guò)程中基因激活的順序[3]。其中，brlA位于中心調(diào)控途徑的上游，該基因的激活是曲霉屬產(chǎn)孢的一個(gè)關(guān)鍵步驟，主要調(diào)控分生孢子梗形成分生孢子囊的過(guò)程[4]。fluG及flbA-E是中心調(diào)控途徑的上游發(fā)育激活因子，調(diào)控?zé)o性產(chǎn)孢的過(guò)程[5-8]。其中，flbD基因編碼Myb型DNA結(jié)合蛋白，它是激活brlA基因表達(dá)所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，已在釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉、煙曲霉和稻瘟病菌等真菌中有過(guò)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)真菌分生孢子的形成至關(guān)重要[9-13]。冠突曲霉在茯磚茶上自然生長(zhǎng)時(shí)，在實(shí)驗(yàn)室低滲條件下培養(yǎng)時(shí)都以形成有性發(fā)育為主，這與大多數(shù)曲霉自然狀態(tài)下先形成無(wú)性發(fā)育不同。因此，探索flbD基因在冠突曲霉無(wú)性產(chǎn)孢過(guò)程的功能，對(duì)理解絲狀真菌的無(wú)性產(chǎn)孢機(jī)制具有重要意義。

目前，構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)及粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)做為模式生物開(kāi)展的無(wú)性發(fā)育及無(wú)性產(chǎn)孢的分子調(diào)控機(jī)制研究較多，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于冠突曲霉無(wú)性產(chǎn)孢調(diào)控機(jī)制的報(bào)道幾乎沒(méi)有。因此，本研究擬以冠突曲霉(Aspergilluscristatus)為材料，期望能獲得flbD基因在該菌無(wú)性發(fā)育中的功能，并初步探究冠突曲霉與模式菌構(gòu)巢曲霉flbD基因功能的異同。

1 材料與方法

1.1 菌株

本試驗(yàn)所用的野生型冠突曲霉和根癌農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensLBA4404均來(lái)源于貴州省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買于擎科生物有限公司，質(zhì)粒pDHt/sk-hyg由中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心王成樹(shù)研究員贈(zèng)送。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

普通瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；潮霉素B、實(shí)時(shí)熒光試劑、卡鈉青霉素、氨芐青霉素鈉及限制性核酸內(nèi)切酶等均購(gòu)買于寶生物工程(大連)有限公司；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；測(cè)序由擎科生物有限公司完成；基本培養(yǎng)基(MM)、誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)、MYA培養(yǎng)基參考劉逸梅等[14]進(jìn)行配制；其余生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 設(shè)計(jì)引物

根據(jù)Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)所需引物，如表1所示。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.4 重組敲除載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

根據(jù)flbD基因及其上下游序列的特征，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)XhoⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ的特異性引物，用于擴(kuò)增flbD基因上﹑下游側(cè)翼序列，并將其酶切后、連接到pDHt/sk-hyg上，經(jīng)驗(yàn)證后得到敲除載體；采用凍融法將重組敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，再運(yùn)用PCR擴(kuò)增后測(cè)序及雙酶切驗(yàn)證。

1.5 敲除株ΔflbD篩選及PCR鑒定

對(duì)含有重組敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R的根癌農(nóng)桿菌與野生型冠突曲霉分生孢子懸液(1×106個(gè)/mL)等體積混勻共培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子，用特異性引物進(jìn)行PCR后驗(yàn)證。

1.6 敲除株ΔflbD拷貝數(shù)驗(yàn)證

應(yīng)用5倍梯度稀釋法，分別將野生型冠突曲霉基因組DNA和質(zhì)粒pDHt/sk-hyg依次進(jìn)行稀釋，通過(guò)擴(kuò)增建立GAPDH和HYG的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于GAPDH和HYG的檢測(cè)，分別以ΔflbD、質(zhì)粒pDHt/sk-hyg、野生型冠突曲霉和空白對(duì)照同時(shí)進(jìn)行，每個(gè)樣重復(fù)3次，根據(jù)Pfaffl法計(jì)算ΔflbD的拷貝數(shù)[16]。

1.7 ΔflbD突變株表型觀察

在不同NaCl濃度的MYA培養(yǎng)基上，在28 ℃下培養(yǎng)野生型冠突曲霉和敲除株ΔflbD，應(yīng)用顯微鏡觀察菌落表型和產(chǎn)孢情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組敲除載體構(gòu)建

運(yùn)用擴(kuò)增上下游同源臂的引物擴(kuò)增flbD基因的上、下游同源臂，長(zhǎng)度分別為585 bp(圖1a)和 857 bp(圖1b)。將上述擴(kuò)增片段與質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)驗(yàn)證后用T4連接酶對(duì)已酶切完全的質(zhì)粒pDHt/sk-hyg和flbD上、下游同源臂進(jìn)行連接，連接后的質(zhì)粒用XhoⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ分別對(duì)其進(jìn)行酶切驗(yàn)證，電泳檢測(cè)酶切的片段大小與預(yù)期一致，分別為9 317和585 bp、9 902和857 bp(圖2)，說(shuō)明上、下游同源臂已經(jīng)成功連接在質(zhì)粒pDHt/sk-hyg上，重組敲除載體構(gòu)建完成。

2.2 敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌驗(yàn)證

將重組敲除質(zhì)粒L-pDHt/sk-hyg-R轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌后，用特異性引物up-flbD-F and R、down-flbD-F and R進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，初步篩選得到農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。再用XhoⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ對(duì)農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(圖3)，PCR擴(kuò)增結(jié)果、酶切結(jié)果均與設(shè)計(jì)結(jié)果一致，說(shuō)明重組敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

注：M為DL2000 DNA Marker圖1 flbD基因上、下游同源臂PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of upstream and downstream homology arms of flbD

注：M為DL15000 DNA Marker；1和2為雙酶切結(jié)果；3為DL2000 DNA Marker圖2 flbD重組質(zhì)粒L-pDHt/sk-hyg-R的雙酶切結(jié)果Fig.2 L-pDHt/sk-hyg-R was digested with double enzyme

注：M為DL15000 DNA Marker；1和2為雙酶切結(jié)果；3為DL2000 DNA Marker圖3 來(lái)自農(nóng)桿菌的重組敲除載體雙酶切結(jié)果Fig.3 Results of recombination vector by double enzyme digestion

2.3 敲除株ΔflbD的PCR鑒定

根據(jù)引物設(shè)計(jì)方案(圖4)，利用跨潮霉素抗性基因hph的引物F1/R1進(jìn)行擴(kuò)增(圖5a)，野生型冠突曲霉擴(kuò)增出2 115 bp的單一條帶；陽(yáng)性敲除轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出3 119 bp的單一條帶。以F2/R2進(jìn)行擴(kuò)增(圖5b)，野生型冠突曲霉擴(kuò)增不出特異性條帶；陽(yáng)性敲除轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出2 114 bp的單一條帶；以F3/R3進(jìn)行擴(kuò)增(圖5c)，野生型冠突曲霉擴(kuò)增不出特異性條帶；陽(yáng)性敲除轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出2 301 bp的單一條帶。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子在預(yù)期位點(diǎn)發(fā)生同源重組，從而將目標(biāo)基因敲除。

圖4 引物設(shè)計(jì)方案Fig.4 Project for designing primers

圖5 敲除株的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 PCR verification results of the mutant

2.4 敲除株ΔflbD拷貝數(shù)驗(yàn)證

2.4.1 內(nèi)源基因和外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

野生型冠突曲霉基因組DNA將作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品，含HYG基因的質(zhì)粒pDHt/sk-hyg DNA作為外源標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增GAPDH和HYG的目標(biāo)片段(圖6a和圖6b)，溶解曲線均為單鋒(圖6c和圖6d)，建立了5倍濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6e和圖6f)，GAPDH和HYG標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.999、0.997，擴(kuò)增效率E值分別為0.933、0.963，擴(kuò)增結(jié)果特異性好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 內(nèi)參基因和潮霉素基因片段的擴(kuò)增、熔解曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Amplification，melting and standard curves of GAPDH and HYG gene

2.4.2 目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)

對(duì)于HYG和GAPDH的擴(kuò)增，分別以△flbD﹑質(zhì)粒pDHt/sk-hyg﹑野生型冠突曲霉和空白對(duì)照同時(shí)進(jìn)行3次重復(fù)反應(yīng)。從擴(kuò)增曲線和溶解曲線可以看出，△flbD中HYG和GAPDH為特異性擴(kuò)增，溶解曲線為單峰(圖7a和圖7b)；質(zhì)粒pDHt/sk-hyg DNA作為GAPDH擴(kuò)增的陰性對(duì)照，它的結(jié)果顯示無(wú)GAPDH的擴(kuò)增；野生型冠突曲霉基因組DNA作為HYG擴(kuò)增的陰性對(duì)照，它的結(jié)果顯示無(wú)HYG的擴(kuò)增；同時(shí)，NTC(空白對(duì)照)無(wú)熒光信號(hào)。

圖7 △flbD中的GADPH及HYG的擴(kuò)增曲線和溶解曲線Fig.7 Amplification and melting curves of the GADPH and HYG from knockout strains

根據(jù)Pfaffl法，當(dāng)N=1時(shí)，可以推斷敲除菌株的拷貝數(shù)為1[16]。通過(guò)計(jì)算得到敲除株ΔflbD的N值接近于1，即敲除株拷貝數(shù)為單拷貝。

2.5 敲除菌株表型觀察

敲除菌株ΔflbD和野生型冠突曲霉的菌落觀察表型(圖8)。結(jié)果顯示：ΔflbD敲除株與野生型菌株的菌落直徑和色素均沒(méi)有明顯差異，但敲除株的菌落呈現(xiàn)蓬松狀，產(chǎn)生了大量“棉花”狀氣生菌絲，且菌落邊緣較稀疏。在3 M NaCl的MYA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，可以看到敲除株產(chǎn)生的分生孢子比野生型的少，并且敲除株的分生孢子主要集中形成于菌落中心。因此，采用馬躍等[17]的研究方法對(duì)含有1 mol/L和3 mol/L NaCl的MYA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的野生型冠突曲霉與ΔflbD菌株進(jìn)行分生孢子計(jì)數(shù)，結(jié)果表明野生型的分生孢子數(shù)量是敲除株的4.7倍，但子囊孢子的數(shù)量幾乎沒(méi)有變化(圖9)；其次，對(duì)野生型與敲除株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果顯示敲除株的分生孢子產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成較野生型延遲(圖10)。這表明flbD基因?qū)谕磺篃o(wú)性發(fā)育及分生孢子的產(chǎn)生了正調(diào)控作用。

圖8 28 ℃培養(yǎng)野生型冠突曲霉(Aspergillus cristatus)與敲除株ΔflbD的菌落表型Fig.8 Phenotype of wild-type and ΔflbD strain of Aspergillus cristatus

圖9 敲除株ΔflbD和野生型冠突曲霉(Aspergillus cristatus)分生孢子和子囊孢子數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.9 Statistics of conidia and ascospore from wild-type and ΔflbD strain of Aspergillus cristatus

3 討論

本研究采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源重組法對(duì)野生型冠突曲霉中flbD基因進(jìn)行敲除，然后觀察flbD基因敲除株的形態(tài)變化，據(jù)此推測(cè)flbD基因在冠突曲霉發(fā)育過(guò)程中的功能。在構(gòu)巢曲霉中，flbD基因是無(wú)性發(fā)育過(guò)程的重要調(diào)控因子之一，構(gòu)巢曲霉中的flbD基因缺失后會(huì)導(dǎo)致分生孢子產(chǎn)生延遲及數(shù)量減少，并可能形成異常子實(shí)體[8-10]。

注：圖B，F(xiàn)(bar：20 μm)；C，E(bar：50 μm)。圖10 ΔflbD突變株與冠突曲霉(Aspergillus cristatus)野生型的觀察結(jié)果Fig.10 Observation results of wild type and ΔflbD strain from Aspergillus cristatus

本研究在獲得flbD敲除株的基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)敲除株的分生孢子少于野生型，同時(shí)在含3M氯化鈉的培養(yǎng)基上，突變株分生孢子的產(chǎn)生有延遲現(xiàn)象，這與構(gòu)巢曲霉的報(bào)道相一致[8-10]。同時(shí)，本研究結(jié)果與禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的flbD基因敲除株相比有明顯差異，禾谷鐮刀菌中flbD基因的缺失將阻止菌絲分化形成分生孢子梗和子囊殼，但冠突曲霉中flbD基因的缺失并不會(huì)阻斷其有性及無(wú)性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成[18]。

構(gòu)巢曲霉的fluG、flbA、flbB、flbC、flbD和flbE基因是激活brlA基因所必須的，如構(gòu)巢曲霉的研究顯示，flbE和flbB相互作用共同激活flbD，flbB又與激活的flbD以互作方式共同激活了brlA的轉(zhuǎn)錄[8]。據(jù)報(bào)道flb家族中的任何基因發(fā)生突變都會(huì)導(dǎo)致形成大量未分化的氣生菌絲，使菌落呈現(xiàn)“蓬松”或棉花狀外觀，最終使brlA表達(dá)量大大降低，課題組前期對(duì)該菌flbA敲除后也出現(xiàn)了類似的表型[7，19]。本文對(duì)冠突曲霉的flbD基因進(jìn)行了敲除，其敲除株的菌落也呈現(xiàn)蓬松狀，同樣產(chǎn)生了大量的“棉花”狀氣生菌絲，并且其分生孢子數(shù)量顯著減少，這些現(xiàn)象與已報(bào)道的構(gòu)巢曲霉相類似。因此，猜測(cè)冠突曲霉的flbD基因?qū)υ摼鸁o(wú)性發(fā)育的調(diào)控方式可能與構(gòu)巢曲霉類似。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)同源重組獲得了flbD基因的敲除菌株，形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果表明冠突曲霉的flbD對(duì)該菌的無(wú)性產(chǎn)孢具有正調(diào)控作用，該基因的缺失將導(dǎo)致冠突曲霉分生孢子減少和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成延遲。本研究將有助于控制冠突曲霉的合適產(chǎn)孢方式和產(chǎn)孢量，從而可促進(jìn)茯磚茶的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展；同時(shí)將為絲狀真菌的無(wú)性發(fā)育研究提供借鑒。