姚未遠(yuǎn)，張文軍，劉優(yōu)雄，周喜新，劉 琪，夏 滔，何激光，楊 柳

（1. 湖南省煙草公司長(zhǎng)沙市公司寧鄉(xiāng)市分公司，湖南 寧鄉(xiāng) 410600；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

氮磷鉀是植物生長(zhǎng)過程中最重要的3 種元素，其中氮元素在植物體內(nèi)參與多種生理過程，氮含量的多少將影響烤煙植株體內(nèi)蛋白質(zhì)、酶、葉綠素和煙堿等重要成分的含量[1-2]。施氮量對(duì)烤煙生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵作用。適宜的氮肥施用量可以促進(jìn)烤煙煙葉的生長(zhǎng)，延緩葉片貪青晚熟，顯著提升煙葉質(zhì)量[3-4]。氮肥施用量不足，烤煙植株的株高、葉片大小都會(huì)下降，煙葉品質(zhì)較差[5-6]。因此，烤煙生育期內(nèi)適宜的土壤氮素供應(yīng)是保障優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的重要前提，土壤氮元素供應(yīng)與煙株氮素吸收不協(xié)調(diào)已經(jīng)逐漸成為限制優(yōu)質(zhì)煙葉原料產(chǎn)出的主要因素[7]。

根際土壤微生物是隨著植物生長(zhǎng)發(fā)育在土壤中逐漸形成的微生物群落[8]。根際土壤微生物中含有大量的可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益菌種——根際促生菌（PGPR）。PGPR 具有促進(jìn)土壤中各類養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、減少土壤中病原菌數(shù)量以及減少土壤污染等重要作用[9]。

長(zhǎng)沙市地處洞庭湖以南地區(qū)，地貌以山地、丘崗、平原為主，屬于亞熱帶大陸性季風(fēng)氣候，擁有四季分明、冬短夏長(zhǎng)的氣候特征，具備優(yōu)質(zhì)烤煙生長(zhǎng)發(fā)育的良好生態(tài)條件，是湖南省主要的烤煙種植區(qū)。研究以云煙87為供試烤煙品種，通過設(shè)置不同施氮水平，研究了氮肥用量對(duì)烤煙生長(zhǎng)期間氮素轉(zhuǎn)化、烤后煙葉主要化學(xué)成分和根際土壤微生物多樣性的影響，以期通過優(yōu)化氮肥投入、建立適宜于煙區(qū)優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的土壤-烤煙-氮素綜合管理措施，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)沙煙區(qū)氮素高效利用與優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及材料

試驗(yàn)于2021 年3—8 月在湖南省長(zhǎng)沙市寧鄉(xiāng)市大屯營(yíng)鄉(xiāng)開展，選取光照充足、排灌便利、往年無土傳病害的代表性優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)田塊（煙葉產(chǎn)量為140～175 kg/667m2）作為試驗(yàn)田，供試烤煙品種為云煙87。供試氮、磷、鉀肥分別為提苗肥、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、硫酸鉀。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)寧鄉(xiāng)市優(yōu)質(zhì)特色烤煙生產(chǎn)技術(shù)方案，推薦施氮量為9.14 kg/667m2（基肥+追肥），設(shè)置4 組氮肥追施量處理，不改變各處理基肥施用量，分別為：CK，基施氮肥6.14 kg/667m2，不追施氮肥；T1，7.14 kg/667m2（基肥+追肥）；T2，8.14 kg/667m2（基肥+追肥）；T3，9.14 kg/667m2（基肥+追肥）；每處理設(shè)置3 組重復(fù)，每個(gè)處理面積為667 m2。各處理后期不施氮肥，磷、鉀肥采用過磷酸鈣、重鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鉀等肥料替代原使用的提苗肥和硝酸鉀產(chǎn)品。在烤煙生長(zhǎng)的旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾打頂期、成熟采烤期對(duì)煙株地上部進(jìn)行采集底腳葉、花蕾及腋芽等樣品，成熟采烤期分上、中、下部葉3 次采收煙葉。同時(shí)，分別在烤煙生長(zhǎng)的旺長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾打頂期、成熟采烤期采集煙株根際土壤樣品，在離煙株5 cm 處利用土鉆采集0～15 cm 耕層土壤，選取每個(gè)處理所在田塊6 個(gè)不同點(diǎn)進(jìn)行取樣，約500 g。

1.3 烤煙樣品測(cè)定指標(biāo)及方法

取新鮮植株樣品，分成莖、葉2 部分，105℃殺青30 min 后，65℃烘干粉碎后測(cè)定其干物質(zhì)重及氮含量，植株含氮量采用凱氏定氮法測(cè)定。

各小區(qū)煙葉采收后按三段式烘烤法烘烤，按烤煙42 級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2635—92）分級(jí)，并測(cè)定各小區(qū)煙葉產(chǎn)量，同時(shí)每個(gè)小區(qū)分別取X2F、C3F、B2F 這3 個(gè)等級(jí)的煙葉各1.5 kg，按照國(guó)標(biāo)分別測(cè)定煙葉氮、鉀、氯、煙堿、淀粉、總糖、還原糖、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分含量。

1.4 土壤樣品采測(cè)定指標(biāo)及方法

在烤煙成熟采烤期取煙株根際土壤，將土壤中礫石、植物組織等分離后放入做好標(biāo)記的50 mL 離心管中，-80℃保存。

采用DNA 抽提試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 檢測(cè)提取的DNA 濃度。以基因組DNA 為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶barcode 的特異引物、Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase 進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR 產(chǎn)物使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后的PCR 產(chǎn)物作為二輪PCR 的模板，進(jìn)行二輪PCR 擴(kuò)增，并再次使用電泳檢測(cè)，檢測(cè)后使用磁珠純化，純化后對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行Qubit 定量，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，并上機(jī)測(cè)序。

1.5 生物多樣性分析

根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，獲得根際土壤微生物群落的OTUs 數(shù)據(jù)，依據(jù)OUTs 數(shù)據(jù)的Alpha 多樣性可以表示特定區(qū)域內(nèi)或生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，該研究通過Chao1、Shannon、ACE、Simpson、Observedspecies、Coverage 等度量指標(biāo)來評(píng)價(jià)物種的豐富度及物種多樣性。其中Chao1 和Observedspecies 指數(shù)值越高，表明根際土壤微生物群落物種豐富度越高；Shannon 和Simpson 指數(shù)值越高，表明根際土壤微生物群落物種的多樣性越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量對(duì)烤煙生長(zhǎng)期間植株含氮量的影響

由表1 可知，不同時(shí)期各處理烤煙不同部位含氮量不同。在旺長(zhǎng)期，烤煙植株含氮量隨氮肥用量增加而顯著增加，T3 處理煙莖和煙葉的含氮量最高；而在打頂期，各處理烤煙植株含氮量隨氮肥用量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，以T2 處理中煙莖和煙葉的含氮量最高；在成熟期時(shí)，T3 處理煙莖含氮量最高，而煙葉含氮量以T2 處理最高。總體來看，T3 處理烤煙在旺長(zhǎng)期氮素養(yǎng)分儲(chǔ)存最好，T2 處理烤煙在打頂期和成熟采烤期氮素養(yǎng)分儲(chǔ)存最好。

表1 不同施肥處理對(duì)烤煙不同時(shí)期含氮量的影響 （%）

2.2 不同施氮量對(duì)烤后煙葉主要化學(xué)成分影響

由表2 可知，對(duì)于下部葉來說，T2 處理烤煙的總糖、還原糖含量最高，氯含量最低；T3 處理的全氮、總蛋白、鉀含量最高，鉀氯比最高；T1 處理的糖堿比最高；綜合對(duì)比，T2、T3 處理有利于烤煙下部葉中各類化學(xué)成分合成。對(duì)中部煙葉來說，T2 處理烤煙的總糖、還原糖、煙堿含量最高，氯含量最低，總糖煙堿比最高；T3 處理烤煙的全氮、總蛋白、鉀含量最高，鉀氯比最高；綜合比較，T2 處理有利于烤煙上部葉中各類化學(xué)成分合成。對(duì)上部煙葉來說，T2處理烤煙的總糖、煙堿、總蛋白、鉀含量最高，鉀氯比最高；T3 處理烤煙的全氮含量最高，氮堿比最高；總體來看，T2處理的烤煙上部葉中各類化學(xué)成分協(xié)調(diào)，品質(zhì)較好。

表2 不同施氮量對(duì)烤煙化學(xué)成分的影響

2.3 不同施氮量對(duì)烤煙根際土壤微生物數(shù)量的影響

由圖1 可知，在屬水平上，CK、T1、T2、T3 處理的細(xì)菌OTUs 數(shù)量分別為1 734、2 289、2 816 和2 345；與CK 相比，T1、T2、T3 處理烤煙根際土壤微生物細(xì)菌OUTs 數(shù)量顯著增加，其中T2 處理增加最顯著。CK、T1、T2、T3 處理的真菌OTUs 數(shù)量分別為297、244、236 和197；與CK 組相比，T1、T2、T3 處理烤煙根際土壤微生物中真菌OTUs 數(shù)量顯著下降，其中T3 處理下降最顯著，其原因可能是過量的氮肥施用影響了真菌的生長(zhǎng)繁殖。

圖1 不同施氮量處理烤煙根際土壤微生物屬水平的數(shù)量

2.4 不同施氮量對(duì)烤煙根際土壤微生物群落多樣性的影響

由表3 可知，與CK 相比，T1、T2、T3 處理的Chao1、Observed species、Shannon 和Simpson 值顯著提高，且T2 處理的指數(shù)提高最顯著，表明適宜的施氮量可以有效提高烤煙根際土壤微生物的物種豐富度和群落多樣性。

表3 不同施氮量處理烤煙根際土壤微生物的Alpha多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

烤煙的產(chǎn)質(zhì)量與其種植過程中氮肥的施用量緊密相關(guān)[10-12]。寧鄉(xiāng)煙區(qū)大田試驗(yàn)結(jié)果表明，T2 處理（8.14 kg/667m2）烤煙在打頂期和成熟期時(shí)，煙莖和煙葉中的氮元素儲(chǔ)存量最高。有研究表明，烤煙生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，植株內(nèi)氮元素的含量對(duì)烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[13]。

烤后煙葉中各項(xiàng)化學(xué)成分是影響烤煙品質(zhì)的主要因素，煙葉中總糖和還原糖的含量對(duì)吃味影響較大[14]。較低的總糖、還原糖含量導(dǎo)致煙葉的吃味較淡，較高的總糖、還原糖含量導(dǎo)致煙葉的吃味平和；煙葉中的蛋白質(zhì)含量越高煙葉等級(jí)越低；鉀元素和氯元素含量共同影響煙葉的燃燒性，氯元素過多時(shí)煙葉中的香氣質(zhì)量會(huì)下降[15-16]。牛德新等[17]等研究發(fā)現(xiàn)，施用過量的氮肥，煙葉中總糖、還原糖含量會(huì)有所降低。在筆者的研究中，綜合3 個(gè)部位煙葉各項(xiàng)化學(xué)指標(biāo)來看，T2處理的烤后煙葉各項(xiàng)化學(xué)成分趨于協(xié)調(diào)，品質(zhì)較好。適宜的施氮量會(huì)增加烤后煙葉的總糖、還原糖、煙堿、總蛋白和鉀的含量，降低氯元素的含量。

根際土壤微生物的變化，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用，不同施氮量處理會(huì)對(duì)烤煙根際土壤微生物產(chǎn)生影響，而根際土壤微生物會(huì)反作用于烤煙植株[18]。微生物群落中的根際促生菌（PGPR）是具有促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)的重要菌群[19-20]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，T2 處理可以有效提高根際土壤微生物的數(shù)量以及根際土壤微生物群落的物種豐富度和多樣性，有利于促進(jìn)烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育。