楊 雄 史正軍 趙長林

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650233）

木質(zhì)素在自然界中含量非常豐富，它是一種擁有極其復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然高分子化合物，在高等植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素廣泛存在，是僅次于纖維素的一種生物多聚體化合物[1-2]，微生物難以降解木質(zhì)素的原因在于木質(zhì)素中各種生物學(xué)穩(wěn)定的復(fù)雜鍵型[3]。如何高效率的利用這類作物資源為目前所研究的熱點課題，傳統(tǒng)工業(yè)制備纖維素材料的方法不僅浪費大量的化學(xué)資源和能源，產(chǎn)生的制漿廢液也污染環(huán)境[4-5]；白腐真菌是目前應(yīng)用廣泛的、公認(rèn)安全環(huán)保且無公害的可以將木質(zhì)素降解為簡單無機物的一類微生物[6]。木材腐朽真菌主要包括白色腐朽菌和褐色腐朽菌2種[7-8]，其中白色腐朽真菌是木材腐朽真菌中最大的類群，包括大部分木生擔(dān)子菌、少數(shù)子囊菌和半知菌[9-13]，大多白腐菌可產(chǎn)生漆酶和錳過氧化物酶，極少數(shù)能產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶[14-16]，使木質(zhì)素發(fā)生側(cè)鏈氧化斷裂、β-芳醚鍵斷裂、芳香環(huán)氧化開裂以及苯環(huán)上脫甲氧基或甲基化反應(yīng)而降解[17]；同時木材腐朽真菌也是森林生物多樣性的重要組成部分，在森林生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵的降解還原作用，能維持森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動[18-20]。

巨龍竹（Dendrocalamus sinicus）屬禾本科竹亞科牡竹屬竹種，熱帶巨大型叢生竹，為我國特有物種，發(fā)現(xiàn)于云南省西南部臨滄、西雙版納地區(qū)，其生長速度快、經(jīng)濟用途廣、生態(tài)效益顯著，作為一種特色明顯的資源植物具有很大的開發(fā)潛力和廣泛的應(yīng)用前景[21-26]；因該物種發(fā)現(xiàn)時間較晚，分布地區(qū)科研資金投入不足、科研水平相對落后，對巨龍竹深入開發(fā)應(yīng)用欠缺，尤其在巨龍竹木質(zhì)素降解研究方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠[27-28]，如巨龍竹在制漿造紙、人造板材和生物精煉工業(yè)領(lǐng)域有極高的開發(fā)潛力，但由于木質(zhì)素的存在導(dǎo)致纖維素在分離過程中呈現(xiàn)耗能高、污染大、耗時多、產(chǎn)量低、其不僅浪費資源同時污染環(huán)境[4-5,29]。因此，針對目前存在木質(zhì)素限制竹資源高效深度開發(fā)利用，傳統(tǒng)物理化學(xué)預(yù)處理方法既不經(jīng)濟又不環(huán)保的問題，本研究提出利用生物方法降解竹材中的木質(zhì)素觀點，并利用固體發(fā)酵法和化學(xué)測定法篩選高效降解巨龍竹木質(zhì)素的菌株；采用形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)學(xué)相結(jié)合方法將該菌株鑒定；通過主成分分析揭示存在的降解類型；運用紫外掃描法揭示木質(zhì)素初步降解機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

野外調(diào)查并采集白色腐朽真菌，并記錄采集編號、采集地點、寄主信息，將新鮮標(biāo)本帶回實驗室進(jìn)行分離純化，將分離純化出的白色腐朽真菌菌株保存于4 ℃冰箱備用。本研究共分離純化出可用于巨龍竹竹材降解的菌株30號（表1），現(xiàn)保藏于西南林業(yè)大學(xué)真菌標(biāo)本館（SWFC）。巨龍竹材料采自于云南省臨滄市的滄源地區(qū)。

表 1 供試白腐菌株Table 1 The information for the test strain of white rot fungi

續(xù)表 1

1.2 竹材降解試驗

1.2.1竹材的固體發(fā)酵

1）將新鮮的巨龍竹切成約3 cm×1 cm×0.3 cm的竹片，放入烘箱105 ℃烘干至恒質(zhì)量。

2）將上述烘干后的竹片取出5 g（精確到0.000 1 g）分別放入培養(yǎng)皿中寫上標(biāo)簽，依次加入適量的水，充分淹沒浸泡12 h。

3）到達(dá)規(guī)定時間后，瀝干表面水分，121 ℃滅菌30 min備用。

4）取供試菌株菌柄餅（約1 cm2）接種在裝有2%麥芽浸粉培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃濕度75%靜置培養(yǎng)。

5）待菌絲長滿培養(yǎng)基表面，放入上述滅菌的5 g竹片，用接種針將其均勻分布于培養(yǎng)基表面，放入恒溫恒濕箱培養(yǎng)箱，溫度28 ℃、濕度75%靜置培養(yǎng)30 d；每個菌種2個重復(fù)，未接種的2組竹片作為空白對照組。

6）30 d后取出樣品，洗去木片表面的菌絲（洗的過程應(yīng)防止竹材的細(xì)小部分掉落，影響失重率的測定），105 ℃風(fēng)干至恒質(zhì)量[30]。

1.2.2竹材化學(xué)組分的測定

用定性濾紙將上述風(fēng)干后的樣品包好并用棉線捆牢，參照國標(biāo)GB/T 2677.6—1994[31]加入苯醇混合液進(jìn)行抽提，每小時約4次循環(huán)，抽提時間為6 h，然后將抽提好的樣本放入烘箱105 ℃烘至恒質(zhì)量，參照國標(biāo)GB/T 2677.10—1995[32]測定綜纖維素含量，參照國標(biāo)GB/T 2677.8—1994測定Klason木素含量[30]。

1.2.3失重率、木質(zhì)纖維素降解率及選擇系數(shù)的計算

1.3 分析方法

1.3.1主成分分析方法

利用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件，將竹材失重率及各化學(xué)變量提取2個主成分并計算其主成分得分系數(shù)。根據(jù)得分系數(shù)計算出每株菌的主成分得分，并做出主成分分析散點圖[30]。

1.3.2紫外掃描分析方法

1）取1 g過40目標(biāo)準(zhǔn)篩的竹粉與適量的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%的麥芽浸粉培養(yǎng)基裝入到三角瓶中（250 mL）滅菌備用；

2）向上述滅菌后的三角瓶中接入供試菌株的菌餅（約1 cm2），放入培養(yǎng)箱恒溫恒濕靜置培養(yǎng)20 d。未接種的作為對照組，處理同上；

3）培養(yǎng)20 d后，向每個三角瓶中加入50 mL 95%乙醇，瓶口覆蓋上錫箔紙，50 ℃發(fā)酵1 h；

4）發(fā)酵結(jié)束后放入冰箱中冷卻至室溫；

5）取2 mL菌液放于離心管中，10 000 r/min離心2 min；

6）取上清液以1∶10的比例與95%乙醇混合稀釋；

7）室溫下測220～400 nm的光譜值[30]。

1.4 菌株鑒定方法

1.4.1DNA提取、PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

OMEGA HP Fungal DNA Kit試劑盒用于SWFU 000072菌株DNA基因組提取[33]。本研究選用ITS基因片段完成系統(tǒng)發(fā)育分析，引物ITS5/ITS4[34]，訂購在生工生物工程（上海）股份有限公司。ITS片度PCR程序參考木腐菌系統(tǒng)發(fā)育研究[33]，產(chǎn)物純化和測序均送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司。

DNA序列用MAFFT version 7（http://mafft.cbr.jp/alignment/server）進(jìn)行比對，手工校正和去掉兩端參差排列后保存為NBRF/PIR格式文件，再用ClustalX 1.83[35]將NBRF/PIR格式文件轉(zhuǎn)化為NEXUS格式文件以及PHYLIP格式文件；經(jīng)過編輯后用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用PAUP* 4.0b10[36]中的最大簡約法（maximum parsimony analysis）；設(shè)置如下：1）非模糊排列的缺失位點處理為新特征（new state）；2）模糊排列位點不予采用；3）進(jìn)行1 000次自持分析[37]；4）所有特征等權(quán)；5）采用啟發(fā)式搜索方式（heuristic search）;（6）Max-trees設(shè)為5 000，其他參數(shù)采用默認(rèn)值[37]。

1.4.2形態(tài)學(xué)研究方法

宏觀研究方法：肉眼直接觀察及在體視顯微鏡下觀察林木腐朽真菌標(biāo)本以下主要特征并拍照記錄：

1）一般特征：一年生/多年生，有柄/菌蓋/平伏反轉(zhuǎn)/平伏，大小，形狀，厚度，質(zhì)地；

2）菌蓋表面：顏色，光滑/粗糙，絨毛/粗毛，環(huán)溝/環(huán)帶，邊緣薄/厚，銳/鈍，孔口形狀及大小。

顯微研究方法：所有顯微研究均在Nikon Eclipse E 100顯微鏡和Leica DM2500（375582）生物正置熒光顯微鏡下進(jìn)行。利用Melzer試劑（簡寫為IKI）、棉藍(lán)試劑（簡寫為CB）和5%氫氧化鉀試劑（簡寫為KOH）作為浮載劑。真菌定名人名稱的縮寫基于國際縮寫標(biāo)準(zhǔn)Authors of Plant Names[38]；有關(guān)子實體的顏色術(shù)語則依據(jù)文獻(xiàn)[39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹材降解試驗結(jié)果

采用30株白腐菌對巨龍竹竹片開展降解試驗，經(jīng)過30 d培養(yǎng)后，竹片失重率、綜纖維素降解率、酸不溶木質(zhì)素降解率發(fā)生變化（表2），其中失重率表示白腐菌對巨龍竹的分解力，其失重率越高表明其對巨龍竹的分解能力越強；由表2可知，巨龍竹竹片的失重率從0.45%至18.36%不等，竹材失重率差距較大，其中SWFU 000096的失重率最高為18.36%，表明其對巨龍竹的降解能力最強，兩菌株SWFU 000089，SWFU 000013次之，失重率依次為15.53%，15.45%。當(dāng)Klason木素降解率與綜纖維降解率的比值（脫木質(zhì)素選擇系數(shù)SI）大于1時，則可以判斷木腐菌產(chǎn)生了選擇性脫木質(zhì)化作用[30]。根據(jù)表2中的選擇系數(shù)SI表明，30個菌株中有10株白腐菌對巨龍竹進(jìn)行了選擇性脫木質(zhì)化作用，其菌株編號分別為SWFU 000072、SWFU 000094、SWFU 000013、SWFU 000084、SWFU 000028、SWFU 000086、SWFU 000074、SWFU 000073、SWFU 000097、SWFU 000080，其SI依次為3.10、2.71、2.04、1.80、1.70、1.66、1.25、1.22、1.09、1.05；盡管SWFU 000096對巨龍竹的分解能力最強，但其沒有發(fā)生脫木質(zhì)化作用，它不加選擇地降解了木質(zhì)素和綜纖維素，其綜纖維降解率高達(dá)19.16%；本研究的目的在于篩選高效選擇性降解巨龍竹木質(zhì)素的白腐真菌，所以該菌株不滿足條件。失重率相對于SWFU 000096稍低的3個菌株SWFU 000072、SWFU 000094、SWFU 000013，SI依次為3.10、2.71、2.04，表明這3個株菌對巨龍竹的選擇性脫木質(zhì)化作用更顯著。其中菌株SWFU 000072對酸不溶木素的降解率高達(dá)19.65%，對綜纖維素的降解率僅有6.39%，且對巨龍竹綜纖維損失極少，綜合供試菌株降解巨龍竹的數(shù)據(jù)分析，通過SPSS軟件分析了失重率和選擇性系數(shù)兩者的相關(guān)性，其相關(guān)性系數(shù)為0.450 12，其表明30株白腐菌降解巨龍竹的能力與其選擇性系數(shù)之間沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。

表 2 30株白腐菌降解巨龍竹30 d后各組分情況Table 2 Degradation of different component of D. sinicus treated by 30 white rot fungi for 30 days

2.2 主成分分析結(jié)果

為進(jìn)一步解析30株白腐真菌對巨龍的降解類型，利用竹材失重率及各化學(xué)變量提取2個主成分（PC），第1主成分和第2主成分分別解釋了85.43%和12.54%的變量，其表明2個主成分能解釋3個指標(biāo)總計97.97%的數(shù)據(jù)量。組分降解率的3個指標(biāo)的數(shù)據(jù)做主成分分析（PCA），其結(jié)果顯示上述3個指標(biāo)。

主成分分析（PCA）結(jié)果為：Klason木質(zhì)素降解率主成分得分系數(shù)PC1=0.345、PC2=1.221，綜纖維降解率主成分得分系數(shù)PC1=0.354、PC2=1.074，失重率主成分得分系數(shù)PC1=0.382、PC2=0.107根據(jù)上述得分系數(shù)利用數(shù)據(jù)處理軟件計算出每株菌的主成分得分，再以表2中30株白腐菌的編號后2位為序號，得出主成分分析散點圖（圖1），其表明當(dāng)PC1的得分越高，失重率、綜纖維素降解率、木質(zhì)素降解率就越大；當(dāng)PC2的得分越高，菌株降解巨龍竹時選擇系數(shù)就越高，結(jié)果表明PC2所反映的是菌株對木質(zhì)素的選擇性降解。本研究主成分分析數(shù)據(jù)變化規(guī)律與微生物在其他植物降解應(yīng)用研究結(jié)果分析趨勢相似[30, 40]。

圖 1 3種指標(biāo)的主成分散點圖Fig. 1 Main dispersion point diagram of 3 indexes

根據(jù)主成分分值高低劃分類型（圖1），30株白腐菌可分為3種主要的降解類型：類型A包含選擇性降解木質(zhì)素的菌株，菌株的選擇系數(shù)也越大，PC2分值也相應(yīng)增高。類型B和C都代表選擇性降解綜纖維素的菌株，但B類型中的菌株對木質(zhì)纖維素的降解能力極其微弱，C類型中的菌株對巨龍竹綜纖維素和木質(zhì)素的降解能力都較強，尤其對綜纖維素的降解能力非常強烈，其降解的強烈程度反映在PC1的分值上，PC1分值越大的菌株則綜纖維素降解率越高。圖1顯示SWFU 000072的PC1得分較低，PC2得分最高，其揭示該菌株擇性降解木質(zhì)素能力在30株白腐菌中最強。

2.3 紫外掃描分析結(jié)果

將選擇性系數(shù)大于1的3個菌株SWFU 000072、SWFU 000013、SWFU 000086接種于過40目篩的巨龍竹粉，發(fā)酵20 d后用95%乙醇對的竹粉進(jìn)行提取，對其提取液進(jìn)行紫外光譜掃描，其紫外掃描光譜圖（圖2）表明空白對照組的在260 nm有明顯的吸收峰，該吸收峰代表木質(zhì)素中芳香環(huán)的吸收[41]；而其他組別在260 nm處無明顯的吸收峰。

圖 2 乙醇提取液的紫外光譜圖Fig. 2 UV spectrum of ethanol extract

2.4 菌株鑒定結(jié)果

形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果：如圖3a所示：擔(dān)子果1年生，菌蓋表面具粗毛和輪紋，菌肉異質(zhì)；如圖3b所示：子實層體初期為孔狀，后期撕裂為齒狀；如圖4所示：菌絲系統(tǒng)三體系，生殖菌絲具索狀聯(lián)合，菌絲在Melzer試劑中無反應(yīng)，在棉藍(lán)試劑中無反應(yīng)，在KOH試劑中無變化。

圖 3 白腐真菌SWFU 000072擔(dān)子果形態(tài)特征Fig. 3 Basidiomata of specimen SWFU 000072

圖 4 白腐菌株SWFU 000072菌落形態(tài)Fig. 4 Colony characters of white rot fungi strain SWFU 000072

基于宏觀生境特征（圖3）、培養(yǎng)菌落性狀及顯微菌絲數(shù)據(jù)（圖4），鑒定其為Cerrena屬水平。

分子系統(tǒng)學(xué)鑒定結(jié)果：如圖5所示，基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株SWFU 000072（GenBank no. MK809429）在系統(tǒng)發(fā)育樹中與分子序列Dai 7 872、Dai 7 359、JXSB1742聚為一個支系，且具有高支持率（100% MP）。因此，該菌株鑒定為Cerrena zonata。

圖 5 白腐菌株SWFU 000072系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 The phylogenetic tree of white rot fungi strain SWFU 000072

3 結(jié)論與討論

本研究從30株白腐真菌中篩選出1株高效降解巨龍竹木質(zhì)素的菌株SWFU 000072，經(jīng)過形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)學(xué)鑒定為Cerrena zonata?；谥鞒煞址治觯≒CA），揭示30株白腐菌存在3種降解類型：選擇性降解木質(zhì)素、選擇性降解綜纖維素、強烈地選擇性降解綜纖維素。通過對巨龍竹粉乙醇提取液進(jìn)行紫外掃描分析表明木質(zhì)素中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)遭到了破壞，進(jìn)而揭示了白腐菌通過破壞木質(zhì)素中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)完成高效降解巨龍竹木質(zhì)素的降解機制。降解木材及農(nóng)林廢棄物木質(zhì)素的真菌在國內(nèi)外相繼報道，如Ceriporiopsis subvermispora，Ganoderma australe，Lentinus edodes，Phanerochaete chrysosporium，Phlebia radiata，Pleurotus ostreatus，Stereum hirsutum，Trametes versicolor，其降解類型屬白色腐朽[30,42-49]。本研究篩選菌株物種為Cerrena zonata，該種隸屬于Cerrenaceae科，Polyporales目，與國內(nèi)已報道多種林木腐朽真菌均為Polyporales目，表明該目物種在降解木材及農(nóng)林廢棄物木質(zhì)素方面具有獨特性，且該種為新整合種類[50]，為未來的深入研究提供了特殊材料。利用白腐真菌降解木質(zhì)素研究結(jié)果揭示白腐菌在木材預(yù)處理階段具有節(jié)約資源、減少污染物的排放、提高產(chǎn)能的優(yōu)勢[51-53]。王偉[54]從23株白腐真菌中篩選出3個高效降解黑楊木質(zhì)素的物種，F(xiàn)unalia trogii，Trametes orientalis，Truncospora ochroleuca，并提出了3株白腐真菌降解黑楊的初步降解機制。本研究采用巨龍竹為研究對象，研究表明竹材失重率比木材失重率較低，分析其主要原因為竹材與木材木質(zhì)素不同，竹材屬于典型的禾草類木質(zhì)素[28]。盡管真菌降解木質(zhì)素已研究多年，但研究成果從實驗室走到大田、生產(chǎn)車間還處在瓶頸期，從成果產(chǎn)出到實際轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生效益還有待繼續(xù)開展深入研究和探索，盡管困難重重，始終堅信通過創(chuàng)新的、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?、科學(xué)的試驗研究必定能開發(fā)出適合工業(yè)生產(chǎn)的高活性白腐菌株和培養(yǎng)體系，解決木質(zhì)纖維素材料高效利用的瓶頸問題[27,29]。我國竹林面積居世界第一[55]，竹資源及其豐富，其孕育了竹資源加工利用及產(chǎn)業(yè)化高效快速發(fā)展的格局，但選擇性去除竹材中的木質(zhì)素極大地限制了竹資源深度利用，已成為竹生物制漿、竹纖維素制備、竹材綜合開發(fā)與利用的卡脖子問題，因此如何高效且有選擇性的去除竹材中木質(zhì)素是一項集基礎(chǔ)科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用轉(zhuǎn)化于一體亟待解決的問題[28,56]。本研究盡管已篩選出高效降解巨龍竹白腐菌株，但是將其從實驗室研究轉(zhuǎn)移至產(chǎn)業(yè)應(yīng)用轉(zhuǎn)化還需要篩選出適應(yīng)性較強的菌株。

隨著化石資源枯竭，生物質(zhì)資源利用研究日益突顯。對于巨龍竹這種在制漿造紙、人造板材和生物煉制等工業(yè)領(lǐng)域表現(xiàn)出極高的研究開發(fā)價值的可再生資源開發(fā)利用刻不容緩[57]，竹木質(zhì)素的去除還是一個未攻克的難題，由于工業(yè)制備纖維素材料時主要靠傳統(tǒng)的高溫高壓、強堿法等方法去除木質(zhì)素，這樣不僅浪費大量的資源和能源也污染環(huán)境。本研究篩選出了能夠選擇性高效降解巨龍竹木質(zhì)素白腐菌株并對其進(jìn)行了鑒定，同時對其初步降解機制進(jìn)行了揭示，為后續(xù)的研究提供一定的理論支持。在后續(xù)的研究中可選定木腐菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件；運用2個或以上菌株同時或先后培養(yǎng)來進(jìn)行預(yù)處理，補足木腐菌在不同降解階段的不同酶系，優(yōu)化共生條件使其脫木質(zhì)程度更高[54]。