周祖陽 劉玉芳 儲明星

摘要 為揭示候選基因 PPP3CA、PLCB1和STK3在 綿羊多羔中的作用，以不同產(chǎn)羔數(shù)小尾寒羊為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測 PPP3CA、PLCB1、STK3基因在小尾寒羊大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮和輸卵管中的表達情況。結(jié)果表明：PPP3CA基 因在小尾寒羊卵巢內(nèi)的相對表達量高于其他組織，其在 FecB? BB型小尾寒羊下丘腦中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），其在 FecB? BB型小尾寒羊輸卵管中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）; PLCB1基因在FecB? BB型小尾寒羊小腦中的相對表達量最高， FecB? BB型小尾寒羊垂體和卵巢組織中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05）; STK3 基因在++型小尾寒羊大腦中的相對表達量高于其他組織，其在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）。該研究結(jié)果表明 PPP3CA、PLCB1、STK3基因可 作為潛在候選基因，參與小尾寒羊多羔性狀的調(diào)控，且具有一定的正向調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞 綿羊;多羔;組織表達; PPP3CA;PLCB1;STK3

中圖分類號 S 813? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）06-0074-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.016

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Study on the Expression Quantity of PPP3CA，PLCB1 and STK3 Genes in Gonadal Axis Tissues of Small Tail Han Sheep

ZHOU Zu-yang1，2，LIU Yu-fang1，2，CHU Ming-xing1 （1.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193;2.College of Life Science and Food Engineering，Hebei University of Engineering，Handan，Hebei 056001）

Abstract In order to reveal the role of candidate genes? PPP3CA，PLCB1，STK3? in multi-lamb sheep，Small Tail Han Sheep with different litter size were used as the research objects in this experiment.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of? PPP3CA，PLCB1? and? STK3? genes in brain，cerebellum，hypothalamus，pituitary gland，ovaries，uterus and oviduct of Small Tail Han Sheep.The results showed that the relative expression quantity of? PPP3CA? gene in the ovaries of Small Tail Han Sheep was higher than that in other tissues，，while its relative expression quantity in the hypothalamus of? FecB? BB type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that in ++ type （ P< 0.05）.The relative expression quantity in the oviduct in BB type was extremely significantly higher than that in ++ type （ P< 0.01）.The relative expression quantity of? PLCB1? gene in the cerebellum of? FecB? BB type Small Tail Han Sheep was the highest，its relative expression quantity in the pituitary and ovarian tissues of BB type Small Tail Han Sheep was significantly higher than that in ++ type Small Tail Han Sheep （ P< 0.05）.The relative expression quantity of? STK3? gene in the brain of ++ type Small Tail Han Sheep was higher than that in other tissues，and its relative expression quantity in the ovary of BB type Small Tail Han Sheep was extremely significantly higher than that in ++ type Small Tail Han Sheep （ P< 0.01）.The research results showed that? PPP3CA，PLCB1? and? STK3? genes could be used as potential candidate genes and involved in the regulation of prolificacy traits in Small Tail Han Sheep，and they had positive regulatory effects.

Key words Sheep;Multi-lamb;Tissue expression; PPP3CA;PLCB1;STK3

基金項目 國家自然科學基金項目（31772580）;國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-38）;中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ZDRW202106，ASTIP-IAS13）;河北省自然科學基金青年項目（C2019402261）。

作者簡介 周祖陽（1994—），男，湖北鄂州人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種研究。*通信作者，研究員，博士，從事肉羊遺傳育種研究。

收稿日期 2021-05-24;修回日期 2021-06-03

綿羊肉質(zhì)細嫩，蛋白質(zhì)含量高，膽固醇含量低，富含人體必需的各種氨基酸、維生素、 礦物質(zhì)元素等，深受消費者的喜愛[1]。綿羊繁殖力受多種因素的調(diào)控，包括遺傳背景、飼養(yǎng)條件、 營養(yǎng)水平等，其中排卵數(shù)能直接影響母羊的產(chǎn)羔數(shù)[2]，而排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)是衡量繁殖力的2個重要指標[3]。因此，研究影響綿羊排卵和產(chǎn)羔性狀的相關(guān)候選基因有助于透析綿羊多羔性狀的分子機理，為提高綿羊繁殖力提供一定的理論參考。

鈣調(diào)磷酸酶是一種鈣依賴的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，它廣泛參與了調(diào)節(jié)機體的多種生理功能[4]。PPP3CA是鈣調(diào)磷酸酶催化亞基A（calcineurin A，CNA）的一種亞型，在動物發(fā)育過程中至關(guān)重要[5]。目前針對 PPP3CA 基因的相關(guān)研究大多集中在肌肉組織和骨骼肌上，研究發(fā)現(xiàn) PPP3CA 基因在調(diào)控骨骼肌纖維中起關(guān)鍵作用，其在不同肌肉組織中均有表達[6]，且能抑制成纖維細胞生長因子23 （FGF23） 的表達，與胰島素樣生長因子1（ IGF1） 共同參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)節(jié)[7-8]。 PPP3CA 基因與繁殖相關(guān)的研究報道較少。Dias等[9]研究發(fā)現(xiàn) PPP3CA 基因?qū)π栽缡煊酗@著影響。另有研究發(fā)現(xiàn)， PPP3CA對雌 激素信號轉(zhuǎn)導和卵母細胞減數(shù)分裂也具有重要作用[10]。此外，在精原干細胞減數(shù)分裂和精子發(fā)生過程中， PPP3CA具 有去磷酸化作用[11]。同時， PPP3CA也 參與了動物胎盤內(nèi)皮細胞功能的調(diào)節(jié)[12]。下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的激活主要依賴于神經(jīng)細胞內(nèi)促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌[13]。KISS1/GPR54信號通路是目前已知的GnRH分泌最重要的通路。以往的研究大多集中于 KISS1、GPR54這兩個基因多態(tài)性的變化，但有研究發(fā)現(xiàn)KISS1、GPR54的信號 需要通過下游關(guān)鍵基因磷脂酶CB1（PLCB1）介導才能傳遞至神經(jīng)細胞內(nèi)，進而發(fā)揮作用[14]。PLCB1是目前研究最廣泛的磷脂酶C（PLC）亞型，在調(diào)節(jié)核肌醇酯信號轉(zhuǎn)導中起著關(guān)鍵作用[15]。汪穩(wěn)[16]研究發(fā)現(xiàn)， PLCB1基 因在23、36、50周齡番鴨卵巢組織中的表達量存在顯著差異（ P< 0.05），與產(chǎn)蛋期相比就巢期和青年期番鴨卵巢組織中 PLCB1 基因的表達量較低，即 PLCB1在產(chǎn) 蛋期卵巢中的表達量高于青年期和就巢期，提示該基因可能在番鴨產(chǎn)蛋過程中起到較強的調(diào)節(jié)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，豬顆粒細胞和卵母細胞中PLC抑制劑和激活劑對4種PLC亞基的基因和蛋白表達有所不同，激活劑處理促進了4種PLC亞基的基因表達，但只有PLCB1蛋白有變化，這表明PLC蛋白中不同亞基發(fā)揮的作用有所不同，并且 PLCB1 可能在豬卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮主要作用[17]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（STK3）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族STE20的成員之一，SKT3在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，其主要功能是促使核小體間DNA碎片化，可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[18]。Moon等[19]研究了STK3在發(fā)情周期小鼠子宮內(nèi)膜中的調(diào)控和表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STK3在發(fā)情周期子宮中的表達是動態(tài)變化的，STK3蛋白表達從發(fā)情間期開始逐漸增加，發(fā)情期達到最高，表明STK3/4-Hippo信號通路在子宮上皮中起著新的信號通路作用，STK3/4-Hippo信號通路是連接雌激素下游信號通路和Hippo信號通路的關(guān)鍵因子之一，從而調(diào)節(jié)發(fā)情周期中子宮上皮的動態(tài)平衡。此外，有研究者利用全基因組測序技術(shù)從大足黑山羊中篩選出與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因 STK3， GO分析發(fā)現(xiàn)其富集在生殖過程相關(guān)的途徑中，表明 STK3可 能是調(diào)控大足黑山羊產(chǎn)羔數(shù)的一個重要候選基因[10]。

小尾寒羊具有生長發(fā)育快、繁殖力高、性能遺傳穩(wěn)定、適應(yīng)性強等優(yōu)點，目前關(guān)于 PPP3CA、PLCB1、STK3 基因在小尾寒羊性腺軸相關(guān)組織的表達研究尚未見文獻報道。筆者選擇 FecB? BB型（多羔純合突變型）和 FecB? ++型（單羔純合野生型）卵泡期小尾寒羊作為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢 測PPP3CA、PLCB1、STK3基 因在小尾寒羊性腺軸各組織中的表達情況，以期為小尾寒羊多羔候選基因的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和樣品采集

選取2～3周歲健康狀況良好、經(jīng)產(chǎn)的6只小尾寒羊母羊用于試驗，其中卵泡期 FecB? BB型（突變型）和 FecB? ++型（野生型）各3只。所有試驗羊只由天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗羊場提供，于2017年10月飼養(yǎng)，所有試驗羊只的飼糧水平和飼養(yǎng)環(huán)境均保持一致。2017年11月將試驗羊只屠宰，屠宰后迅速采集其大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管等組織，然后裝入1.8 mL無菌、無酶凍存管中（采集樣品量不超過凍存管容積的2/3）[20]，迅速放入液氮罐中冷凍保存，并帶回實驗室放入-80 ℃冰箱中冷凍備用。

1.2 RNA提取及質(zhì)量檢測

將采集的組織樣品在液氮中研磨，并用Trizol試劑（Invitrogen，美國）進行裂解，然后根據(jù)動物組織總RNA提取試劑盒（天根，北京）說明書進行總RNA提取?？俁NA提取完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，并使用NanoDrop 2000分光光度計檢測提取RNA的質(zhì)量和濃度。將無明顯降解、OD260/OD280為1.8～2.2的RNA置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA合成

以1.0 μg總RNA作為模板，使用TaKaRa PrimeScriptTM RT Reagent Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄

體系（20 μL）如下：5×PrimeScript Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O將反應(yīng)總體積補至20 μL。反應(yīng)程序如下：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄全程快速在冰上進行。將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA進行5倍稀釋，用持家基因 RPL-19進 行PCR產(chǎn)物檢測，經(jīng)檢測合格后于-20 ℃下保存，作為后續(xù)實時熒光定量檢測的模板[20]。

1.4 熒光定量PCR引物設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的綿羊 PPP3CA、PLCB1、STK3和RPL-19基 因序列（登錄號分別為XM_027970857.1、XM_012188093.3、XM_027973184.1和XM_004012836.3）信息，熒光定量引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，以 RPL- 19作為持家基因。引物合成由北京天一輝遠生物科技有限公司完成。所有引物均加水稀釋至濃度10 μmol/L。引物詳細信息見表1。

1.5 實時熒光定量PCR

以 RPL- 19基因作為持家基因，使用Roche Light Cycler480 Ⅱ 型熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系（20 μL）如下：TB Green Premix Ex? Taq? Ⅱ 10 μL，PCR Primer（Forward Primer &Reverse Primer）0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 預(yù)變性5 s;95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán);反應(yīng)結(jié)束后，對熔解曲線進行分析。

1.6 標準曲線的繪制

取適量cDNA樣本，2倍等比稀釋，制備5個濃度梯度[1、1/2、（1/2）2、（1/2）3、（1/2）4]的cDNA樣本。將這些cDNA作為模板，對目的基因和內(nèi)參基因進行熒光定量PCR。以 Ct 值為縱坐標，以濃度梯度的對數(shù)值（以10為底數(shù)）為橫坐標，繪制目的基因和內(nèi)參基因 RPL-19 的標準曲線[20]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

目的基因的相對表達量采用2-ΔΔ Ct 法計算。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用 t 檢驗進行差異顯著性分析。 P< 0.05表示差異顯著， P< 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取 利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行總RNA的質(zhì)量檢測，電泳結(jié)果顯示28S條帶明顯亮于18S條帶，表明RNA完整性較好，提取的RNA質(zhì)量合格，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試驗。

2.2? PPP3CA、PLCB1和STK3 基因在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析

2.2.1? PPP3CA 在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析。實時熒光定量PCR結(jié)果表明， PPP3CA 基因在BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量最高，在++型小尾寒羊子宮中的相對表達量最低。 PPP3CA 基因在 FecB? BB型小尾寒羊下丘腦中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），在 FecB? BB型小尾寒羊輸卵管中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）（圖1）。

2.2.2? PLCB1 基因在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示， PLCB1基 因在 FecB? BB型小尾寒羊小腦中的相對表達量最高，其在 FecB? BB型小尾寒羊垂體和卵巢組織中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05）（圖2）。

2.2.3? STK3 基因在不同基因型小尾寒羊各性腺軸組織中的表達量分析。 STK3 基因在 FecB? ++型小尾寒羊大腦中的相對表達量最高，其在++型和BB型小尾寒羊大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管中均有表達。 STK3 基因在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01）（圖3）。

3 討論

下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的調(diào)節(jié)是控制哺乳動物繁殖力的關(guān)鍵，是調(diào)控哺乳動物性激素分泌最重要的系統(tǒng)[21]。PPP3CA是蛋白磷酸酶3（protein phosphatase 3，PPP3）的催化亞基A。在蛋白磷酸酶3催化（PPP3C）的3種亞基中，PPP3CA和PPP3CB廣泛存在于真核生物的多種細胞中[22]，其中 PPP3CA基 因已被證實參與牛肌肉前脂肪細胞的分化[23]。 PPP3CA 在動物生殖生理中扮演著重要的角色，包括其在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF） 和成纖維細胞生長因子2 （FGF2） 刺激胎盤動脈內(nèi)皮細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導中的作用[24]。在精子發(fā)生過程中 PPP3CA通 過去磷酸化來調(diào)節(jié)精子的減數(shù)分裂，另外有研究發(fā)現(xiàn) PPP3CA 的SNP變異與豬的產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)[10]。該研究中 PPP3CA 基因在BB型小尾寒羊下丘腦中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），其在BB型小尾寒羊輸卵管中的相對表達量極顯著高于++型（ P< 0.01），且該基因在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量較++型小尾寒羊有所增加，提示該基因可能通過小尾寒羊性腺軸相關(guān)組織上的表達來正向調(diào)節(jié)小尾寒羊的繁殖性狀。敖葉等[25]研究發(fā)現(xiàn)， PPP3CA 基因在單羔組黔北麻羊卵巢、輸卵管、下丘腦中的相對表達量顯著高于多羔組（ P< 0.05），與該研究結(jié)果有一定差異，推測這種差異可能是由于物種不同所致。

PLCB1基 因在Wnt/Ca2+通路中起重要作用，PLC酶負責內(nèi)膜組分磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP 2）通過水解產(chǎn)生第二信使IP3和DAG，這2種酶都導致細胞內(nèi)Ca2+的釋放，而Ca2+穩(wěn)態(tài)可能在卵母細胞和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[26-27]。有研究者利用RNA-seq和全基因組甲基化測序方法對不同光周期條件下綿羊下丘腦表觀遺傳變化進行研究，篩選出參與光周期調(diào)控綿羊下丘腦功能的主要mRNAs（如 PLCB1、RASD1和KCNJ5 等），光周期改變時 PLCB1 參與了胰島素分泌，該結(jié)果表明在晝夜節(jié)律通路中一些關(guān)鍵基因的表達變化會促進胰島素的分泌，從而激活下丘腦功能區(qū)的受體，進一步調(diào)節(jié)綿羊因光周期誘導而進行的一系列生殖活動[28]。另有研究發(fā)現(xiàn) PLCB1 在癌變過程中上調(diào)[29];Molinari等[30]指出 PLCB1在 乳腺癌中拷貝數(shù)的變化，其表達水平與組織學分級和增殖指數(shù)有關(guān)。汪穩(wěn)[16]研究發(fā)現(xiàn) PLCB1 基因可能在番鴨產(chǎn)蛋過程中起到較強的調(diào)節(jié)作用。陳華麗[17]研究表明 PLCB1基因可 能在豬卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮主要作用。該研究中 PLCB1 基因在 FecB? BB型小尾寒羊小腦中的相對表達量高于其他性腺軸組織，其在 FecB? BB型小尾寒羊垂體和卵巢組織中的相對表達量顯著高于++型（ P< 0.05），推測該基因?qū)π∥埠虻母叻敝沉π誀罹哂幸欢ǖ拇龠M作用。

STK3是Hippo信號通路的一個關(guān)鍵分子，它控制細胞的發(fā)育、增殖、凋亡以及各種應(yīng)激反應(yīng)[31]。目前，關(guān)于STK3的研究主要集中在癌癥方面。Wang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，STK3抑制卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移，卵巢癌細胞過表達 STK3 后，細胞周期阻滯于G2/M期，細胞凋亡率增加。然而，關(guān)于 STK3 基因在動物繁殖方面的報道較少。研究表明，含WW結(jié)構(gòu)域的人同源重組蛋白1（SAV1）在體外顯著促進了STK4或STK3激酶誘導的大腫瘤抑制激酶1（LATS1）的磷酸化，LATS1的磷酸化和活性抑制卵巢卵泡的發(fā)育，從而阻止卵巢發(fā)育過程中的卵泡選擇[33-34]。E等[10]基于全基因組測序結(jié)果篩選出大足黑山羊的多羔候選基因 STK3 ，與該研究結(jié)果相一致。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，小尾寒羊性腺軸各組織中 STK3 基因均有一定表達，其在 FecB? BB型小尾寒羊卵巢中的相對表達量極顯著高于++型 （ P< 0.01），提示該基因可能是調(diào)控小尾寒羊多羔性狀的一個重要候選基因。

4 結(jié)論

PPP3CA、PLCB1、STK3基 因在小尾寒羊性腺軸各組織中均有表達。

PPP3CA 基因在小尾寒羊下丘腦、輸卵管中的相對表達量在單羔和多羔群體間存在顯著差異， PLCB1 基因在單羔和多羔群體垂體組織中的相對表達量存在顯著差異， PLCB1和STK3 基因在單羔和多羔群體卵巢組織中的相對表達量存在顯著差異。該研究結(jié)果表明 PPP3CA、PLCB1、STK3 基因可作為調(diào)控小尾寒羊多羔性狀的重要候選基因，為闡明綿羊高繁殖力的分子機理提供了一定參考。

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