咸 豐，路戰(zhàn)遠(yuǎn)，張建中，陳立宇，程玉臣，楊建強(qiáng)，張向前，蘇 和

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.阿拉善盟農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古巴彥浩特 750306）

棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，不僅是紡織業(yè)主要的天然纖維原料作物，也是動(dòng)物飼用蛋白以及人類食用油的重要資源。我國(guó)是棉花生產(chǎn)大國(guó)，也是消費(fèi)大國(guó)，但自給率僅為70%左右，進(jìn)口率仍高達(dá)30%，極大地制約著我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。隨著我國(guó)棉花新品種培育速度的加快以及骨干親本的集中使用和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，棉花品種間的遺傳差異越來越小[2-4]。因此，如何充分利用現(xiàn)有棉花種質(zhì)資源進(jìn)行育種，實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)性狀有突破性進(jìn)展已迫在眉睫。

分子標(biāo)記是基于DNA 多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，可以直接反映個(gè)體在DNA 水平上的差異，具有許多其他標(biāo)記無法比擬的優(yōu)勢(shì)[5-6]，其中，SSR分子標(biāo)記（又稱微衛(wèi)星DNA），是一類由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列[7]，具有共顯性、多態(tài)性強(qiáng)、可復(fù)制性強(qiáng)、基因組覆蓋范圍廣等特點(diǎn)[8]。SSR 標(biāo)記作為一種理想的分子標(biāo)記，在棉花種質(zhì)資源多樣性評(píng)價(jià)和遺傳研究中也有較多應(yīng)用，BOURGOU 等[9]利用SSR分子標(biāo)記分析了當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)棉花種質(zhì)的遺傳多樣性，并與現(xiàn)有品種的多樣性進(jìn)行了比較。賈子昉等[10]利用SSR分子標(biāo)記分析了300 份棉花種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為進(jìn)一步開展育種工作提供了理論依據(jù)。石建斌等[11]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)58 份棉花種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，這些資源聚類與其地理生態(tài)來源無關(guān)，而與材料的親緣關(guān)系相關(guān)性較高。衛(wèi)澤等[12]通過表型聚類和SSR分子標(biāo)記聚類研究了國(guó)內(nèi)外57 份棉花種質(zhì)的遺傳多樣性，各聚類結(jié)果表明，同一國(guó)家的品種遺傳差異較小，國(guó)家間品種差異較大，但也存在明顯的相互滲透，多數(shù)品種沒有表現(xiàn)出明顯的地域差異。高偉等[13]對(duì)60 份四倍體棉種材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，從1 050對(duì)SSR 引物篩選出的95 對(duì)SSR 引物均能在60 份材料間擴(kuò)增出穩(wěn)定明顯的多態(tài)性條帶，共檢測(cè)出660 個(gè)片段，其中多態(tài)性片段584 個(gè)，占88.5%，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?～12 個(gè)，平均每對(duì)引物6.1 個(gè)。

鑒于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院棉花研究中心早熟棉種質(zhì)資源來源廣泛，資源豐富，為弄清現(xiàn)有早熟棉種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，本試驗(yàn)利用SSR分子標(biāo)記對(duì)44 份早熟棉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為棉花種質(zhì)資源鑒定、育種親本選擇、新品種改良培育、重要基因挖掘等工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的44 份早熟棉種質(zhì)資源，均由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院棉花研究中心收集、保存和種植（表1）。

表1 供試早熟棉種質(zhì)資源的編號(hào)、名稱及來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棉花基因組DNA 的提取

試驗(yàn)于2019年春季在棉花研究中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，每個(gè)品種育苗10 株，待2～3 片真葉時(shí)，每份材料隨機(jī)選擇新鮮幼嫩葉片4～5 片，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用改良的CTAB 法提取棉花葉片基因組DNA[14]，用紫外分光核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA 濃度及質(zhì)量，將DNA 稀釋到80 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR 引物多態(tài)性擴(kuò)增

所用SSR 引物序列見表2，參考張玉翠等[15]、潘兆娥等[16]的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix（康為世紀(jì)）10 μL，DNA 模板1 μL，10 mmol/L 引物各0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48～54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測(cè)。

表2 SSR 引物及其序列

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)記錄時(shí)，只統(tǒng)計(jì)3 次重復(fù)試驗(yàn)中穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶，將任一擴(kuò)增條帶作為一個(gè)等位位點(diǎn)，按條帶的有/無分別賦值1/0，建立二元數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc V2.10 軟件中的Qualitative date 函數(shù)計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)（Jaccard 系數(shù)）；利用非加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均數(shù)法（unweight pair group method using arithmetic averages，UPGMA）進(jìn)行聚類分析；最后，采用Treeplot 模塊生成樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 引物多態(tài)性分析

本試驗(yàn)用篩選出的31 對(duì)條帶清晰且擴(kuò)增多態(tài)性較好的引物，對(duì)44 份早熟棉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，在目標(biāo)群體中檢測(cè)出72 條多態(tài)性條帶，每對(duì)引物擴(kuò)增1～6 條，平均能夠擴(kuò)增出2.25 條。其中，NAU1200、CIR216、BNL3140、NAU859、DPL0442、NAU5099，6 對(duì)SSR 引物僅檢測(cè)到1 個(gè)等位基因，而MUCS101 和NAU3110 檢測(cè)到6 個(gè)等位基因（圖1）。

圖1 NAU1200（a）、CIR216（b）、MUCS101（c）和NAU3110（d）引物對(duì)44 份早熟棉材料擴(kuò)增的電泳譜

2.2 早熟棉親緣關(guān)系的聚類分析

依據(jù)UPGMA 法對(duì)供試的44 份早熟棉種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性聚類分析（圖2），供試44 份早熟棉種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)為0.35～0.80，平均為0.58。其中，C35（酒棉17 號(hào)）與C38（中716）相似系數(shù)最小，僅為0.35；相似系數(shù)較小的還有C43（中361）與C31（泗陽）、C3（源棉2 號(hào)）與C40（遼棉23 號(hào)），分別為0.37、0.38，C43（中361）與C30（遼棉20 號(hào)）、C14（遼7083）與C25（酒棉10 號(hào)）均為0.39；C13（新陸早26 號(hào)）與C40（遼棉23 號(hào)）、C42（遼棉25 號(hào)）與C28（51822）、C42（遼棉75 號(hào)）與C30（遼棉20 號(hào)）均為0.40，表明材料間的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。相反，C20（新陸早41 號(hào)）與C43（中361）、C9（中夏05）與C11（遼棉15 號(hào)）的相似系數(shù)最大，均為0.80，表明材料間的遺傳相似性較高，基因組間差異較小，親緣關(guān)系較密切。此外，追溯各材料的來源及其遺傳背景，發(fā)現(xiàn)來源于河南豫研種子科技有限公司的C19（宛13-1）和C23（宛13-3）也表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，表明選育背景具有較大相似性。聚類結(jié)果相對(duì)較客觀地反映了44 份材料間的親緣關(guān)系。

圖2 早熟棉種質(zhì)資源的UPGMA 聚類結(jié)果

3 討論與結(jié)論

對(duì)現(xiàn)有早熟棉材料的遺傳多樣性進(jìn)行聚類分析，明確種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)和分類，有助于棉花的育種研究。同時(shí)運(yùn)用分子生物學(xué)的方法從基因水平上分析種質(zhì)資源的多樣性，可以充分挖掘棉花種質(zhì)資源的豐富基因。潘兆娥等[16]通過構(gòu)建棉花參比種質(zhì)，高效快速地篩選出319 對(duì)核心SSR 引物，為棉花品種間遺傳多樣性的評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。賀道華等[17]利用分布于棉花全基因組的132 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)精選的92 個(gè)棉花品種（系）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，92 個(gè)品種之間的成對(duì)相似系數(shù)平均為0.729 2±0.135 0。董章輝等[18]利用22 對(duì)SSR 多態(tài)性引物共擴(kuò)增出30 條多態(tài)性條帶，遺傳多樣性分析表明，83 份早熟抗蟲棉材料的相似系數(shù)為0.73～0.98。陳浩東等[19]利用68 對(duì)SSR引物，對(duì)15 份短季棉材料進(jìn)行了聚類分析，共檢測(cè)出178 個(gè)有效等位位點(diǎn)，平均每對(duì)引物檢測(cè)到2.62 個(gè)，各材料基因型間遺傳相似系數(shù)為0.45～0.79。王欣怡等[20]利用78 對(duì)SSR 多態(tài)性引物在120 個(gè)新疆陸地棉材料中檢測(cè)到392 個(gè)等位位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)324 個(gè)，多態(tài)性比例達(dá)82.7%；聚類分析顯示，120 個(gè)陸地棉品種遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.50～0.96，平均為0.73。翟書偉等[21]利用39 對(duì)SSR 多態(tài)性引物在26 份棉花材料中檢測(cè)到99 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.73 時(shí)，可聚為4 類。本試驗(yàn)利用篩選的31 對(duì)SSR 引物對(duì)早熟棉品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，44 份早熟棉品種間的遺傳相似系數(shù)分布在0.35～0.80，平均為0.58，與前人相比遺傳相似系數(shù)較低，也表明我國(guó)早熟棉遺傳多樣性高，遺傳背景差異較大，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較廣，但部分材料基本接近，可能是由于育種研究者在選育新種質(zhì)的工作中育種目標(biāo)過于單一，一些棉花遺傳背景多樣性逐漸喪失[22-23]所致。

綜上所述，本試驗(yàn)利用31 對(duì)SSR 引物在44 份早熟棉品種中檢測(cè)出72 條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物檢測(cè)到2.25 條。聚類分析表明，被測(cè)材料間的遺傳相似系數(shù)為0.35～0.80，平均為0.58，初步揭示了現(xiàn)有44 份早熟棉資源間的遺傳背景差異及其相互親緣關(guān)系，為下一步合理高效選擇雜交親本以及進(jìn)行雜交選育等提供了理論依據(jù)。