畢瑞鋒, 鄧鎖成, 付 萌, 張偉偉, 張義霞

(1. 諾安實(shí)力可商品檢驗(yàn)(青島)有限公司，山東 青島 266012；2. 梅里埃營養(yǎng)科學(xué)集團(tuán)（中國） 研發(fā)部，山東 青島 266012)

百菌清是一種廣譜高效保護(hù)性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、水稻等農(nóng)作物種植過程中真菌性病害的防治。4-羥基百菌清是百菌清的主要代謝物，與百菌清母體相比，4-羥基百菌清的毒性更強(qiáng)[1]。鑒于百菌清對魚類和兩棲類動物有較高風(fēng)險，且降解產(chǎn)物也可能對地下水有較高污染，自2019 年5 月20 日起，歐盟不再批準(zhǔn)百菌清的再評審申請[2]。中國雖然批準(zhǔn)百菌清在多種農(nóng)作物上使用，但要求百菌清殘留量低于GB 2763—2021 規(guī)定的最大殘留限量 (MRL)[3]。與GB 2763—2021 規(guī)定的百菌清的殘留物定義不同，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定在農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)和植物源性食品膳食風(fēng)險評估時百菌清的殘留物定義為百菌清和4-羥基百菌清，即需要同時檢測百菌清和4-羥基百菌清。

百菌清的檢測方法主要有氣相色譜法[4-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]；4-羥基百菌清的檢測方法主要是液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)質(zhì)譜法[6,8,14]。盡管目前已經(jīng)有甲酯化衍生-氣相色譜法[15]、高效液相色譜法[16]和酶聯(lián)免疫法[17]等百菌清和4-羥基百菌清的同時檢測方法，但這些方法存在操作步驟繁瑣、靈敏度低和易受干擾等缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用較少，迫切需要建立靈敏度高、專屬性好和操作簡便的可同時檢測百菌清和4-羥基百菌清的分析方法。大氣壓化學(xué)電離源(APCI) 可以實(shí)現(xiàn)百菌清分子的軟電離，李凌云等[18]采用液相色譜-大氣壓化學(xué)電離源-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了蔬菜中百菌清的檢測方法，不過該方法沒有解決百菌清在蕓薹屬類蔬菜中回收率低的問題。

QuEChERS 方法是近些年發(fā)展起來的農(nóng)藥殘留檢測樣品前處理技術(shù)，具有操作簡便、分析速度快及溶劑用量少等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于提取蔬菜水果中不同極性范圍的農(nóng)藥殘留。采用QuEChERS方法提取百菌清時回收率往往偏低，這主要與pH值和基質(zhì)種類有關(guān)。本研究以改進(jìn)的QuEChERS技術(shù)作為前處理方法，采用配備APCI 源的高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 進(jìn)行檢測，建立了蔬菜水果中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留的快速同時檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB Sciex 6500 QTRAP 型HPLC-MS/MS 儀，配有APCI 源 (美國AB Sciex 公司)；旋渦混合器(德國IKA 公司)；Geno/Grinder 組織研磨機(jī) (美國SPEX SamplePrep 公司)；X3R 型臺式離心機(jī) (美國Thermo-Fisher 公司)；50 mL 聚丙烯離心管 (美國BD 公司) 。

百菌清(chlorothalonil，純度98.51%) 和4-羥基百菌清(chlorothalonil-4-hydroxy，純度99.0%)標(biāo)準(zhǔn)品 (德國Dr. Ehrenstorfer 公司)；乙腈和甲醇(HPLC 級，美國Merck 公司)；甲酸銨 (色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；乙酸 (分析純，美國Sigma 公司)；濃硫酸(分析純，煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司)；磷酸 (分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸鈉和氯化鈉 (分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)有限公司)；無水硫酸鎂 (分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；試驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10 g (精確至0.01 g)經(jīng)均質(zhì)處理的新鮮蔬菜水果樣品，置于50 mL 離心管中，加入1 mL 10%硫酸溶液，渦旋混合1 min，加入10 mL乙腈，置于組織研磨機(jī)上劇烈振搖1 min。分別加入1 g 氯化鈉和4 g 無水硫酸鎂，立即搖散，再置于組織研磨機(jī)上劇烈振蕩1 min，然后以3 500 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm 尼龍濾膜，待測。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

百菌清標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取10 mg (精確至0.01 mg) 百菌清標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并且定容至刻度，于 -18 ℃避光保存。

4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取10 mg(精確至0.01 mg) 4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并且定容至刻度，于 -18 ℃避光保存。

5 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用體積分?jǐn)?shù)為1%的硫酸-乙腈溶液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃冰箱避光保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)28 d 的穩(wěn)定性考察，百菌清和4-羥基百菌清的損失均小于10%，故將有效期定為28 d。

以結(jié)球甘藍(lán)空白樣品為例，按照1.2 節(jié)的方法提取樣品，得到空白基質(zhì)溶液，用該空白基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，外標(biāo)法定量。以百菌清和4-羥基百菌清的峰面積為縱坐標(biāo) (y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (x)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，權(quán)重選擇1/x。

1.4 儀器檢測條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex 色譜柱(100 mm × 2.1 mm，2.6 μm)；柱溫40 ℃；流動相A 為乙腈，B 為5.0 mmol/L 甲酸銨水溶液；流速0.7 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% A；＞0.5～5.5 min，10% A～95% A；＞5.5～7.5 min，95% A；＞7.5～7.6 min，95% A～10% A；＞7.6～10.0 min，10% A。進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：APCI 源；負(fù)離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式；氣簾氣壓力1.38 × 105Pa；碰撞氣壓力6.21 × 104Pa；電暈針電流3 μA；蒸發(fā)溫度550 ℃；噴霧氣壓力3.45 × 105Pa。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 百菌清及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of chlorothalonil and its metabolite

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的建立

在APCI 負(fù)離子模式下，分別對百菌清和4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子掃描，未檢測到百菌清的準(zhǔn)分子離子峰，但能檢測到比百菌清相對分子量小于19 u 的離子峰m/z244.9、m/z246.9和m/z248.9，同位素豐度比為3 : 3 : 1，根據(jù)此結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)報道[18]，可以推測該離子峰是百菌清分子發(fā)生脫氯加氧親核取代反應(yīng)后的產(chǎn)物離子[M-Cl + O]-，這與4-羥基百菌清掃描得到的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-的質(zhì)荷比及同位素豐度比一致，百菌清和4-羥基百菌清的母離子均為m/z244.9。

進(jìn)行子離子模式掃描，在百菌清和4-羥基百菌清的二級質(zhì)譜圖中，均得到m/z146.9、m/z174.9、m/z181.9 和m/z209.9 較強(qiáng)的碎片離子。推測m/z209.9 為母離子失去一個Cl 原子后的碎片離子，m/z174.9 為母離子失去兩個Cl 原子后的碎片離子，m/z181.9 為母離子失去一個Cl 原子和一個羰基后的碎片離子，m/z146.9 為母離子失去兩個Cl 原子和一個羰基后的碎片離子。對去簇電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。在優(yōu)化后的質(zhì)譜條件下進(jìn)行MRM 模式檢測，無論是百菌清還是4-羥基百菌清，均是m/z181.9 離子的響應(yīng)最高，因此選擇m/z181.9 作為定量離子，剩余3 個響應(yīng)較弱的離子m/z174.9、m/z209.9 和m/z146.9 作為定性離子，百菌清和4-羥基百菌清共用定量和定性離子通道。

2.2 色譜條件的建立

考察了甲醇-5 mmol/L 甲酸銨水溶液、乙腈-5 mmol/L 甲酸銨水溶液作為流動相時百菌清和4-羥基百菌清的色譜行為和響應(yīng)靈敏度。結(jié)果顯示：有機(jī)相無論采用甲醇還是乙腈，兩個目標(biāo)分析物在色譜柱上均能獲得良好的保留和分離效果，采用乙腈時兩個目標(biāo)分析物的響應(yīng)更高，其中4-羥基百菌清的響應(yīng)為采用甲醇時響應(yīng)的兩倍以上；此外，采用乙腈時儀器系統(tǒng)壓力更低。綜上，最終選擇乙腈-5 mmol/L 甲酸銨水溶液作為流動相。優(yōu)化后的百菌清及其代謝物的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 百菌清及其代謝物的MRM 色譜圖Fig. 1 MRM chromatogram of chlorothalonil and its metabolite

2.3 前處理方法的優(yōu)化

百菌清在中性條件下穩(wěn)定性較差，本研究發(fā)現(xiàn)：采用乙腈配制質(zhì)量濃度為5 mg/L 的百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4 ℃下放置36 h 后，百菌清的濃度降低23.4%，其中14.8%轉(zhuǎn)化為4-羥基百菌清。另有研究發(fā)現(xiàn)，采用同樣的前處理方式，結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜等蕓薹屬類蔬菜基質(zhì)中百菌清的添加回收率偏低[18]，不同樣品基質(zhì)中百菌清的回收率不同。

為提高樣品提取過程中百菌清的穩(wěn)定性和回收率，通常在樣品中加入硫酸[4]或者磷酸[5,16]，調(diào)節(jié)提取環(huán)境至酸性。本研究中，對傳統(tǒng)QuEChERS方法 (AOAC 2007.01) 的前處理步驟進(jìn)行改進(jìn)，用硫酸或者磷酸代替乙酸 (0.1 mL)/乙酸鈉 (1.5 g) 緩沖鹽。選擇結(jié)球甘藍(lán)作為樣品基質(zhì)，比較了加入不同體積 (0.1、0.5 和1 mL) 10%硫酸或10%磷酸時目標(biāo)分析物的回收率。為了對比改進(jìn)效果，同時考察了不添加酸度調(diào)節(jié)劑和酸度調(diào)節(jié)劑為乙酸(0.1 mL)/乙酸鈉 (1.5 g) 緩沖鹽 (傳統(tǒng)QuEChERS方法) 時目標(biāo)分析物的回收率?？疾鞎r添加水平為0.2 mg/kg，每處理重復(fù)3 次 (n=3) 。

結(jié)果 (圖2) 發(fā)現(xiàn)：1) 對于百菌清，當(dāng)不添加酸度調(diào)節(jié)劑時，平均回收率只有10%左右；當(dāng)添加乙酸/乙酸鈉緩沖鹽時，平均回收率比不添加酸度調(diào)節(jié)劑雖有所改善，但回收率和重復(fù)性仍比較差，表明傳統(tǒng)QuEChERS 方法不適用于結(jié)球甘藍(lán)中百菌清的檢測；采用10%硫酸溶液作為酸度調(diào)節(jié)劑，當(dāng)添加量為0.1 mL 時，百菌清的平均回收率和重復(fù)性較差，當(dāng)添加量大于0.5 mL 時，平均回收率提升到95%以上；采用10%磷酸溶液作為酸度調(diào)節(jié)劑，添加量為0.1 mL 時，百菌清平均回收率為78%，當(dāng)添加量大于0.5 mL 時，平均回收率提升到95%以上。2) 對于4-羥基百菌清，不論采用何種酸度調(diào)節(jié)劑甚至不添加酸度調(diào)節(jié)劑，回收率都在88%～100%之間，說明酸度調(diào)節(jié)劑對4-羥基百菌清的回收率影響不大。總之，硫酸和磷酸均可作為酸度調(diào)節(jié)劑用于QuEChERS 方法檢測百菌清和4-羥基百菌清，考慮到QuEChERS 方法中已使用無機(jī)鹽硫酸鎂，故最終選擇以10%的硫酸為酸度調(diào)節(jié)劑，用量為1 mL。無論是在標(biāo)準(zhǔn)工作溶液貯存過程，還是結(jié)球甘藍(lán)樣品前處理過程，酸性環(huán)境中百菌清的穩(wěn)定性和回收率均更好，因此在檢測其他基質(zhì)樣品時均采用酸化乙腈進(jìn)行提取。

圖2 酸度調(diào)節(jié)劑對目標(biāo)分析物回收率的影響Fig. 2 Effect of acid regulators on the recoveries of the target analytes

與前人[4-5,16]的前處理方法相比，本研究采用酸化乙腈作為提取溶劑，避免了使用丙酮等不適合直接進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析的提取溶劑，同時省去了溶劑置換和凈化等步驟，試驗(yàn)操作更加簡單。

2.4 方法的線性范圍和定量限

結(jié)果 (表2) 表明：百菌清及其代謝物在0.005～0.2 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，決定系數(shù) (R2) 均大于0.99。選擇結(jié)球甘藍(lán)空白樣品，定量添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照10 倍信噪比，則百菌清和4-羥基百菌清的定量限均為0.01 mg/kg。

表2 百菌清及其代謝物的線性方程、線性范圍、決定系數(shù)和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, R2 and LOQs for chlorothalonil and its metabolite

2.5 方法的正確度和精密度

向結(jié)球甘藍(lán)、黃瓜、葡萄和蘋果4 種基質(zhì)空白樣品中分別添加0.01、0.05 和0.2 mg/kg 3 個水平的百菌清及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)6 次。結(jié)果 (表3) 表明：百菌清的平均回收率為83%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為1.0%～7.5%，4-羥基百菌清的平均回收率為83%～104%，RSD為0.73%～7.7%，方法的正確度和精密度均滿足要求[19]。

表3 百菌清及其代謝物在4 種基質(zhì)中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of chlorothalonil and its metabolite spiked in the four matrices (n=6)

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

通過比較結(jié)球甘藍(lán)、黃瓜、葡萄和蘋果空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，對基質(zhì)效應(yīng) (Me) 進(jìn)行評價。當(dāng)|Me|＜20%時可忽略不計(jì)；當(dāng)|Me|＞20%時表示存在基質(zhì)效應(yīng)，需采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法等方式對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正[20]。本研究表明，百菌清及其代謝物在4 種樣品基質(zhì)中的|Me|值均小于20%，基質(zhì)效應(yīng)可忽略，不過為了獲得更準(zhǔn)確的方法學(xué)回收率數(shù)據(jù)，仍采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法建立工作曲線。

2.7 實(shí)際樣品測定

采用本研究建立的方法對26 份送至本實(shí)驗(yàn)室的蔬菜水果樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：分別有1 份草莓樣品、1 份蘋果樣品和1 份番茄樣品檢出百菌清，含量分別為0.031、0.015 和0.018 mg/kg；所有樣品均未檢出4-羥基百菌清。GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定，草莓、蘋果和番茄中百菌清的MRL 值分別為5、1 和5 mg/kg[3]，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，本研究所檢樣品中百菌清的殘留量均未超標(biāo)。

3 結(jié)論

采用改進(jìn)的QuEChERS 方法結(jié)合APCI 離子化的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了同時測定蔬菜水果中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留的方法。本方法具有簡單快速、準(zhǔn)確度高、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。與文獻(xiàn)方法[18]相比，本研究解決了百菌清在標(biāo)準(zhǔn)品儲存環(huán)節(jié)和樣品前處理過程中易降解的問題，極大提高了方法的可靠性，不僅為開展百菌清的農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)和膳食風(fēng)險評估提供了技術(shù)支持，也為蔬菜水果中百菌清的常規(guī)監(jiān)控提供了一種快速手段。