曹 云, 侯宗敏, 董存柱, 曹鳳勤, 陶 敏,余森泉, 夏玉蓮, 伍顯鋒

(海南大學 植物保護學院，熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228)

海洋真菌在特殊的生存環(huán)境下生命力強，不僅具有特殊的代謝途徑和防御體制，還能夠產生大量結構新穎、功能豐富的次生代謝物，已成為研發(fā)新型藥物先導化合物的熱點[1]。截至目前，從海洋真菌的次生代謝產物中已分離鑒定出大量結構新穎的化合物，部分化合物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌或抗病毒等藥理學活性[2-3]。黃瑞環(huán)從哈茨木霉Trichoderma hrzianum的次生代謝產物中分離得到兩個Nafuredin 類化合物，發(fā)現(xiàn)其對稻瘟病菌均具有抑制作用[4]。Gao 等從短柄青霉菌Penicillium brefeldianum次生代謝物中分離出3 種新化合物，發(fā)現(xiàn)部分化合物對人類腫瘤細胞HepG2 和 MDA-MB-231 表現(xiàn)出細胞毒性[5]。

微生物混合發(fā)酵由來已久，已廣泛應用于傳統(tǒng)微生物工業(yè)和食品工業(yè)。Cueto 等發(fā)現(xiàn)，當海洋真菌Pestalotiasp. CNL-365 與一株對抗生素有抗性的海洋細菌CNJ-328 進行混合發(fā)酵時，可以產生一個新的抗生素pestalone，而單獨發(fā)酵則不產生該化合物[6]。因此，將微生物混合發(fā)酵技術運用于海洋真菌次級代謝產物的研究，有望挖掘出大量結構新穎的活性化合物[7-8]。

基于此，本研究將來源于海南東寨港紅樹林海泥中的哈茨木霉T. harzianumABC19819 和短柄青霉菌P. brefeldianumABC190807 進行混合發(fā)酵，對其次級代謝產物進行了系統(tǒng)的分離鑒定，從中分離得到6 個化合物，采用波譜分析技術并通過文獻對比，對化合物的結構進行了鑒定，并以埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲試蟲測定了6 個化合物的殺蟲活性?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器與試劑 Bruker DRX-600 型核磁共振波譜儀 (T M S 為內標，德國B r u k e r 公司)；Finnigan LCQ Advantage MAX 型液相色譜-質譜聯(lián)用儀 (美國熱電公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋YM75(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；冷卻水循環(huán)裝置CA-1111 和水流抽氣機A1000S (日本EYELA公司)；凝膠Sephadex LH-20 (美國GE 公司)；硅膠薄層色譜板GF254 和柱色譜用硅膠60～80 目(篩孔徑180～250 μm)，200～300 目 (篩孔徑48～75 μm) (青島海洋化工集團公司)，柱色譜試劑均為國產分析純，瓊脂粉、葡萄糖、75% 乙醇、99.5%二甲基亞砜(西隴科學股份有限公司)；魚藤酮 (rotenone，純度為95%，Aladdin 試劑公司)；99.8%氘代試劑 (北京伊諾凱科技有限公司)。

1.1.2 試驗菌株 菌株Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807分離于海南東寨港紅樹林海泥，菌種由海南大學植物保護學院天然源農藥實驗室通過分子生物學與形態(tài)學進行鑒定并保存。埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲由海南大學植物保護學院化保實驗室提供。

1.1.3 菌種純化 無菌操作下，將適量樣品置于含有50 mL 無菌海水的100 mL 三角瓶中，攪拌均勻，靜置。吸取1 mL 上清液于含有9 mL 無菌海水的20 mL 試管中，按照濃度梯度稀釋法配制成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的溶液[9]。取150 μL各濃度溶液加入PDA 培養(yǎng)基 (3 個重復) ，以涂布器涂布均勻，將培養(yǎng)皿封口，倒置培養(yǎng)。觀察菌種生長情況，用接種針挑取出新長出的菌絲接種到空白PDA 培養(yǎng)基上，待新培養(yǎng)基上的真菌長出菌絲后，重復操作，直到得到純化真菌，并進行菌種保藏備用。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng) 海水PDB 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，以海水定容至1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：1 000 mL 發(fā)酵瓶，大米80 g，天然海水100 mL。

將保藏的菌種活化備用。配制10 瓶PDB 液體培養(yǎng)基和135 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后待用。將純化的2 株真菌各自接入5 瓶PDB 培養(yǎng)基中，于26 ℃、180 r/min 的條件下培養(yǎng)3 d，作為真菌種子液。分別接種3 mL 真菌種子液到135 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26 ℃靜置混合發(fā)酵培養(yǎng)45 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取與分離 發(fā)酵45 d 后，向每個發(fā)酵瓶中加入600 mL 乙酸乙酯，搗碎攪拌后靜置3 d，期間振蕩若干次。抽濾，濃縮得到發(fā)酵液浸膏；回收乙酸乙酯后再次加入提取，如此反復3 次。合并浸膏，共得到浸膏394.14 g，置入4 ℃冰箱內備用。以60～80 目硅膠拌樣 (硅膠與樣品質量比為1 : 1)，200～300 目硅膠裝柱分離樣品。先用薄層層析 (TLC) 法確定分離系統(tǒng)：以石油醚-乙酸乙酯 (體積比分別為100 : 0, 95 : 5, 90 : 10, 85 : 15,80 : 20, 75 : 25, 70 : 30, 65 : 35, 60 : 40, 55 : 45, 50 :50, 45 : 55, 40 : 60, 35 : 65, 20 : 80, 0 : 100) 進行梯度洗脫，再用乙酸乙酯-甲醇 (體積比90 : 10, 65 :35, 30 : 70, 0 : 100) 洗脫。經檢驗，合并得到18 個部分 (Fr.1～18)。Fr. 1，1.76 g；Fr. 2，1.37 g；Fr. 3，1.59 g；Fr. 4，9.51 g；Fr. 5，2.07 g；Fr. 6，2.15 g；Fr. 7，3.64 g；Fr. 8，5.07 g；Fr. 9，3.17 g；Fr. 10，2.76 g；Fr. 11，3.15 g；Fr. 12，2.77 g；Fr. 13，3.29 g；Fr. 14，2.35 g；Fr.15，2.69 g；Fr. 16，1.71 g；Fr. 17，1.53 g；Fr. 18，1.43 g。將所得各部分進行分離純化。Fr. 1-2、Fr. 5 和Fr. 9-18 因其所含化合物過于混雜，在分離過程中沒有得到純化合物。Fr. 3 經凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 :1 洗脫得化合物1 (63.7 mg)。Fr. 4 經硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =90 : 10 洗脫得到Fr. 4-1，經硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =85 :15 洗脫得到Fr. 4-2；Fr. 4-1 經凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物2 (158.8 mg)。Fr. 4-2 經凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物3 (78.9 mg)。Fr. 6 經硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =65 : 35 洗脫得到Fr. 6-1，F(xiàn)r. 6-1 經凝膠柱色譜甲醇洗脫得化合物4 (58.2 mg)。Fr. 7 經硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =70 :30 洗脫得到Fr. 7-1，F(xiàn)r. 7-1 經凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物5 (84.6 mg)。Fr. 8 經凝膠柱色譜甲醇洗脫得化合物6 (103.5 mg)。

1.2.2 化合物的結構鑒定

化合物4：白色針狀晶體 (甲醇) ，熔點為210 ℃。其NMR 數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致。1H NMR (600 MHz, DMSOd6),δ: 5.98 (s, H-C(5), 1H)，2.13 (s, H-C(8), 3H)，1.73 (s, HC(7), 3H)；13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ: 165.0 (C=O,C-2)，164.9 (C=C, C-4)，159.2 (C=C, C-6)，99.7 (C=C, C-5)，96.2 (C=C, C-3), 19.1 (CH3, C-8)，8.2 (CH3, C-7)。ESIMS (m/z): 139 [M-H]-給出分子離子峰，結合1H NMR 和13C NMR 數(shù)據(jù)，推導其分子式為C7H8O3，結合文獻數(shù)據(jù) (熔點為209～211 ℃[17])，鑒定化合物4 為4-羥基-3, 6-二甲基-2H-吡喃酮。

6 種化合物的結構式見圖式1。

圖式1 化合物1～6 的化學結構Scheme 1 Structures of compounds 1-6

1.3 殺蟲活性測定

1.3.1 對埃及伊蚊的活性初篩 分別稱取25 mg供試化合物，加入1 mL 二甲基亞砜溶解，用去離子水定容至50 mL，得到化合物質量濃度為500 mg/L的藥液，備用。以相同質量濃度的魚藤酮作為藥劑對照，以含等量溶劑的去離子水溶液作為空白對照。采用浸漬法[22]測定各化合物對埃及伊蚊3 齡幼蟲的殺蟲活性。每處理重復3 次，每重復用滴管吸取20 只大小均一、發(fā)育一致的埃及伊蚊3 齡幼蟲。分別于處理后12、24、36 和72 h 統(tǒng)計結果，記錄幼蟲死亡數(shù)，并計算校正死亡率。以蟲體僵直、尾部明顯變黑，浮于藥液上或沉于底部者判為死亡。

1.3.2 測定高活性化合物對埃及伊蚊的LC50值

以含1 mL 二甲基亞砜的去離子水為溶劑，配制質量濃度為4 000 mg/L 的母液，繼而用去離子水稀釋成系列質量濃度分別為400、300、200、100 和50 mg/L 的藥液。處理方法同1.3.1 節(jié)，于72 h 觀察記錄死亡蟲數(shù)，采用DPS v9.50 軟件統(tǒng)計分析72 h 試蟲死亡結果，并計算LC50值。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 分別按公式 (1)、 (2) 計算死亡率(M1)和校正死亡率(M2)：

式中：K為死亡蟲數(shù)，N為處理總蟲數(shù)，M0為空白對照組的死亡率。

采用DPS v9.50 軟件統(tǒng)計分析不同處理間的差異顯著性 (Duncan’s 新復極差測定法)，采用毒力回歸方法進行毒力測定[23]。

2 結果與分析

2.1 殺蟲活性

結果 (表1) 表明，在分離得到的6 個化合物中，只有化合物1 和3 對埃及伊蚊3 齡幼蟲表現(xiàn)出不同程度的毒殺活性，且致死率均隨時間的延長而增加，其中在72 h 時，化合物1 的校正死亡率達100%，化合物3 的校正死亡率達80%以上，故對這兩個化合物進一步進行了毒力測定。

表1 500 mg/L 化合物1～6 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的殺蟲活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

表1 500 mg/L 化合物1～6 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的殺蟲活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著 (P＜0.05，DMRT 法) ；“—” 表示無毒殺作用。Note: Data followed different letters within colum indicate significant differences at 0.05 level. "—" indicate no larvicidal activity.

X±SD校正死亡率 (, n = 3)成分Compounds Adjusted mortality rate/%12 h24 h36 h72 h 173.33±7.64 b 83.33±2.89 b 86.67±2.89 b 100.00±0.00 a 2——6.67±3.33 c 358.33±2.89 c 70.00±5.00 c 78.33±5.77 c 81.66±2.89 b 4———8.33±2.89 c 6——5——CK——魚藤酮 rotenone 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a

線性回歸分析結果 (表2) 表明：化合物1 和3 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的毒力在72 h 后均呈現(xiàn)清晰的劑量-效應關系?；衔? 和3 的LC50值分別為162 mg/L 和240 mg/L，高于魚藤酮的LC50值13.4 mg/L，說明兩個化合物殺蟲活性不如魚藤酮。

表2 72 h 化合物1 和3 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的LC50 值Table 2 LC50 value of compound 1 and 3 after 72 h against the third instar larvae of Aedes aegypti

3 結論與討論

本研究從海洋真菌Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807混合發(fā)酵的次級代謝產物中分離得到6 個化合物，分別鑒定為agathic acid (1)、4-羥基苯甲醛(2)、nafuredin (3)、4-羥基-3,6-二甲基-2H-吡喃酮(4)、甲瓦龍酸內酯 (5)和brefeldin A (6)。其中化合物1 和3 表現(xiàn)出明顯的殺埃及伊蚊幼蟲活性，進一步表明了混合發(fā)酵技術有可能成為尋找活性天然產物的有效途徑?；旌习l(fā)酵與單獨發(fā)酵獲得的次生代謝物有所不同，單獨發(fā)酵時，從哈茨木霉主要分離出二肽類化合物[4], 從短柄青霉菌中主要分離出吲哚生物堿[24]，而混合發(fā)酵可以除同時分離出兩種真菌所具有的次生代謝物，如化合物Nafuredin，還可以分離出單獨發(fā)酵時未獲得次生代謝物，如化合物agathic acid。據(jù)文獻報道，agathic acid 具有抗炎、抗病毒活性[25]；nafuredin具有抗菌活性[26]，而有關agathic acid 和nafuredin的殺蟲活性未見報道，本研究豐富了其殺蟲活性。另外，兩個活性化合物的結構相對簡單，易于進行結構修飾，可作為研發(fā)生物殺蟲劑的先導化合物進一步研究。