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        兩種海洋真菌混合發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物及殺蟲活性研究

        2022-04-09 06:38:42侯宗敏董存柱曹鳳勤余森泉夏玉蓮伍顯鋒
        農(nóng)藥學學報 2022年2期
        關(guān)鍵詞:伊蚊殺蟲硅膠

        曹 云, 侯宗敏, 董存柱, 曹鳳勤, 陶 敏,余森泉, 夏玉蓮, 伍顯鋒

        (海南大學 植物保護學院,熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點實驗室,???570228)

        海洋真菌在特殊的生存環(huán)境下生命力強,不僅具有特殊的代謝途徑和防御體制,還能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、功能豐富的次生代謝物,已成為研發(fā)新型藥物先導化合物的熱點[1]。截至目前,從海洋真菌的次生代謝產(chǎn)物中已分離鑒定出大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物,部分化合物表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗菌或抗病毒等藥理學活性[2-3]。黃瑞環(huán)從哈茨木霉Trichoderma hrzianum的次生代謝產(chǎn)物中分離得到兩個Nafuredin 類化合物,發(fā)現(xiàn)其對稻瘟病菌均具有抑制作用[4]。Gao 等從短柄青霉菌Penicillium brefeldianum次生代謝物中分離出3 種新化合物,發(fā)現(xiàn)部分化合物對人類腫瘤細胞HepG2 和 MDA-MB-231 表現(xiàn)出細胞毒性[5]。

        微生物混合發(fā)酵由來已久,已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)微生物工業(yè)和食品工業(yè)。Cueto 等發(fā)現(xiàn),當海洋真菌Pestalotiasp. CNL-365 與一株對抗生素有抗性的海洋細菌CNJ-328 進行混合發(fā)酵時,可以產(chǎn)生一個新的抗生素pestalone,而單獨發(fā)酵則不產(chǎn)生該化合物[6]。因此,將微生物混合發(fā)酵技術(shù)運用于海洋真菌次級代謝產(chǎn)物的研究,有望挖掘出大量結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物[7-8]。

        基于此,本研究將來源于海南東寨港紅樹林海泥中的哈茨木霉T. harzianumABC19819 和短柄青霉菌P. brefeldianumABC190807 進行混合發(fā)酵,對其次級代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)的分離鑒定,從中分離得到6 個化合物,采用波譜分析技術(shù)并通過文獻對比,對化合物的結(jié)構(gòu)進行了鑒定,并以埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲試蟲測定了6 個化合物的殺蟲活性?,F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        1.1.1 儀器與試劑 Bruker DRX-600 型核磁共振波譜儀 (T M S 為內(nèi)標,德國B r u k e r 公司);Finnigan LCQ Advantage MAX 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國熱電公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋YM75(上海三申醫(yī)療器械有限公司);冷卻水循環(huán)裝置CA-1111 和水流抽氣機A1000S (日本EYELA公司);凝膠Sephadex LH-20 (美國GE 公司);硅膠薄層色譜板GF254 和柱色譜用硅膠60~80 目(篩孔徑180~250 μm),200~300 目 (篩孔徑48~75 μm) (青島海洋化工集團公司),柱色譜試劑均為國產(chǎn)分析純,瓊脂粉、葡萄糖、75% 乙醇、99.5%二甲基亞砜(西隴科學股份有限公司);魚藤酮 (rotenone,純度為95%,Aladdin 試劑公司);99.8%氘代試劑 (北京伊諾凱科技有限公司)。

        1.1.2 試驗菌株 菌株Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807分離于海南東寨港紅樹林海泥,菌種由海南大學植物保護學院天然源農(nóng)藥實驗室通過分子生物學與形態(tài)學進行鑒定并保存。埃及伊蚊Aedes aegypti3 齡幼蟲由海南大學植物保護學院化保實驗室提供。

        1.1.3 菌種純化 無菌操作下,將適量樣品置于含有50 mL 無菌海水的100 mL 三角瓶中,攪拌均勻,靜置。吸取1 mL 上清液于含有9 mL 無菌海水的20 mL 試管中,按照濃度梯度稀釋法配制成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的溶液[9]。取150 μL各濃度溶液加入PDA 培養(yǎng)基 (3 個重復(fù)) ,以涂布器涂布均勻,將培養(yǎng)皿封口,倒置培養(yǎng)。觀察菌種生長情況,用接種針挑取出新長出的菌絲接種到空白PDA 培養(yǎng)基上,待新培養(yǎng)基上的真菌長出菌絲后,重復(fù)操作,直到得到純化真菌,并進行菌種保藏備用。

        1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng) 海水PDB 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,以海水定容至1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基:1 000 mL 發(fā)酵瓶,大米80 g,天然海水100 mL。

        將保藏的菌種活化備用。配制10 瓶PDB 液體培養(yǎng)基和135 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后待用。將純化的2 株真菌各自接入5 瓶PDB 培養(yǎng)基中,于26 ℃、180 r/min 的條件下培養(yǎng)3 d,作為真菌種子液。分別接種3 mL 真菌種子液到135 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,于26 ℃靜置混合發(fā)酵培養(yǎng)45 d。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 提取與分離 發(fā)酵45 d 后,向每個發(fā)酵瓶中加入600 mL 乙酸乙酯,搗碎攪拌后靜置3 d,期間振蕩若干次。抽濾,濃縮得到發(fā)酵液浸膏;回收乙酸乙酯后再次加入提取,如此反復(fù)3 次。合并浸膏,共得到浸膏394.14 g,置入4 ℃冰箱內(nèi)備用。以60~80 目硅膠拌樣 (硅膠與樣品質(zhì)量比為1 : 1),200~300 目硅膠裝柱分離樣品。先用薄層層析 (TLC) 法確定分離系統(tǒng):以石油醚-乙酸乙酯 (體積比分別為100 : 0, 95 : 5, 90 : 10, 85 : 15,80 : 20, 75 : 25, 70 : 30, 65 : 35, 60 : 40, 55 : 45, 50 :50, 45 : 55, 40 : 60, 35 : 65, 20 : 80, 0 : 100) 進行梯度洗脫,再用乙酸乙酯-甲醇 (體積比90 : 10, 65 :35, 30 : 70, 0 : 100) 洗脫。經(jīng)檢驗,合并得到18 個部分 (Fr.1~18)。Fr. 1,1.76 g;Fr. 2,1.37 g;Fr. 3,1.59 g;Fr. 4,9.51 g;Fr. 5,2.07 g;Fr. 6,2.15 g;Fr. 7,3.64 g;Fr. 8,5.07 g;Fr. 9,3.17 g;Fr. 10,2.76 g;Fr. 11,3.15 g;Fr. 12,2.77 g;Fr. 13,3.29 g;Fr. 14,2.35 g;Fr.15,2.69 g;Fr. 16,1.71 g;Fr. 17,1.53 g;Fr. 18,1.43 g。將所得各部分進行分離純化。Fr. 1-2、Fr. 5 和Fr. 9-18 因其所含化合物過于混雜,在分離過程中沒有得到純化合物。Fr. 3 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 :1 洗脫得化合物1 (63.7 mg)。Fr. 4 經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =90 : 10 洗脫得到Fr. 4-1,經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =85 :15 洗脫得到Fr. 4-2;Fr. 4-1 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物2 (158.8 mg)。Fr. 4-2 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物3 (78.9 mg)。Fr. 6 經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =65 : 35 洗脫得到Fr. 6-1,F(xiàn)r. 6-1 經(jīng)凝膠柱色譜甲醇洗脫得化合物4 (58.2 mg)。Fr. 7 經(jīng)硅膠柱色譜V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =70 :30 洗脫得到Fr. 7-1,F(xiàn)r. 7-1 經(jīng)凝膠柱色譜V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脫得化合物5 (84.6 mg)。Fr. 8 經(jīng)凝膠柱色譜甲醇洗脫得化合物6 (103.5 mg)。

        1.2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

        化合物4:白色針狀晶體 (甲醇) ,熔點為210 ℃。其NMR 數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致。1H NMR (600 MHz, DMSOd6),δ: 5.98 (s, H-C(5), 1H),2.13 (s, H-C(8), 3H),1.73 (s, HC(7), 3H);13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ: 165.0 (C=O,C-2),164.9 (C=C, C-4),159.2 (C=C, C-6),99.7 (C=C, C-5),96.2 (C=C, C-3), 19.1 (CH3, C-8),8.2 (CH3, C-7)。ESIMS (m/z): 139 [M-H]-給出分子離子峰,結(jié)合1H NMR 和13C NMR 數(shù)據(jù),推導其分子式為C7H8O3,結(jié)合文獻數(shù)據(jù) (熔點為209~211 ℃[17]),鑒定化合物4 為4-羥基-3, 6-二甲基-2H-吡喃酮。

        6 種化合物的結(jié)構(gòu)式見圖式1。

        圖式1 化合物1~6 的化學結(jié)構(gòu)Scheme 1 Structures of compounds 1-6

        1.3 殺蟲活性測定

        1.3.1 對埃及伊蚊的活性初篩 分別稱取25 mg供試化合物,加入1 mL 二甲基亞砜溶解,用去離子水定容至50 mL,得到化合物質(zhì)量濃度為500 mg/L的藥液,備用。以相同質(zhì)量濃度的魚藤酮作為藥劑對照,以含等量溶劑的去離子水溶液作為空白對照。采用浸漬法[22]測定各化合物對埃及伊蚊3 齡幼蟲的殺蟲活性。每處理重復(fù)3 次,每重復(fù)用滴管吸取20 只大小均一、發(fā)育一致的埃及伊蚊3 齡幼蟲。分別于處理后12、24、36 和72 h 統(tǒng)計結(jié)果,記錄幼蟲死亡數(shù),并計算校正死亡率。以蟲體僵直、尾部明顯變黑,浮于藥液上或沉于底部者判為死亡。

        1.3.2 測定高活性化合物對埃及伊蚊的LC50值

        以含1 mL 二甲基亞砜的去離子水為溶劑,配制質(zhì)量濃度為4 000 mg/L 的母液,繼而用去離子水稀釋成系列質(zhì)量濃度分別為400、300、200、100 和50 mg/L 的藥液。處理方法同1.3.1 節(jié),于72 h 觀察記錄死亡蟲數(shù),采用DPS v9.50 軟件統(tǒng)計分析72 h 試蟲死亡結(jié)果,并計算LC50值。

        1.3.3 數(shù)據(jù)處理 分別按公式 (1)、 (2) 計算死亡率(M1)和校正死亡率(M2):

        式中:K為死亡蟲數(shù),N為處理總蟲數(shù),M0為空白對照組的死亡率。

        采用DPS v9.50 軟件統(tǒng)計分析不同處理間的差異顯著性 (Duncan’s 新復(fù)極差測定法),采用毒力回歸方法進行毒力測定[23]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 殺蟲活性

        結(jié)果 (表1) 表明,在分離得到的6 個化合物中,只有化合物1 和3 對埃及伊蚊3 齡幼蟲表現(xiàn)出不同程度的毒殺活性,且致死率均隨時間的延長而增加,其中在72 h 時,化合物1 的校正死亡率達100%,化合物3 的校正死亡率達80%以上,故對這兩個化合物進一步進行了毒力測定。

        表1 500 mg/L 化合物1~6 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的殺蟲活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

        表1 500 mg/L 化合物1~6 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的殺蟲活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

        注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05,DMRT 法) ;“—” 表示無毒殺作用。Note: Data followed different letters within colum indicate significant differences at 0.05 level. "—" indicate no larvicidal activity.

        X±SD校正死亡率 (, n = 3)成分Compounds Adjusted mortality rate/%12 h24 h36 h72 h 173.33±7.64 b 83.33±2.89 b 86.67±2.89 b 100.00±0.00 a 2——6.67±3.33 c 358.33±2.89 c 70.00±5.00 c 78.33±5.77 c 81.66±2.89 b 4———8.33±2.89 c 6——5——CK——魚藤酮 rotenone 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a

        線性回歸分析結(jié)果 (表2) 表明:化合物1 和3 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的毒力在72 h 后均呈現(xiàn)清晰的劑量-效應(yīng)關(guān)系。化合物1 和3 的LC50值分別為162 mg/L 和240 mg/L,高于魚藤酮的LC50值13.4 mg/L,說明兩個化合物殺蟲活性不如魚藤酮。

        表2 72 h 化合物1 和3 對埃及伊蚊3 齡幼蟲的LC50 值Table 2 LC50 value of compound 1 and 3 after 72 h against the third instar larvae of Aedes aegypti

        3 結(jié)論與討論

        本研究從海洋真菌Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807混合發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物中分離得到6 個化合物,分別鑒定為agathic acid (1)、4-羥基苯甲醛(2)、nafuredin (3)、4-羥基-3,6-二甲基-2H-吡喃酮(4)、甲瓦龍酸內(nèi)酯 (5)和brefeldin A (6)。其中化合物1 和3 表現(xiàn)出明顯的殺埃及伊蚊幼蟲活性,進一步表明了混合發(fā)酵技術(shù)有可能成為尋找活性天然產(chǎn)物的有效途徑?;旌习l(fā)酵與單獨發(fā)酵獲得的次生代謝物有所不同,單獨發(fā)酵時,從哈茨木霉主要分離出二肽類化合物[4], 從短柄青霉菌中主要分離出吲哚生物堿[24],而混合發(fā)酵可以除同時分離出兩種真菌所具有的次生代謝物,如化合物Nafuredin,還可以分離出單獨發(fā)酵時未獲得次生代謝物,如化合物agathic acid。據(jù)文獻報道,agathic acid 具有抗炎、抗病毒活性[25];nafuredin具有抗菌活性[26],而有關(guān)agathic acid 和nafuredin的殺蟲活性未見報道,本研究豐富了其殺蟲活性。另外,兩個活性化合物的結(jié)構(gòu)相對簡單,易于進行結(jié)構(gòu)修飾,可作為研發(fā)生物殺蟲劑的先導化合物進一步研究。

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