李淑鈺 宋闿迪 姚雯 耿良權(quán) 皖湘 湯寶林 朱小玉 孫自敏 劉會蘭，

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液科（合肥230001）；2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科（合肥230001）

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoi-etic stem cell transplantion，allo-HSCT）是目前惡性血液病患者的重要治愈手段之一，但移植后血小板植入延遲（delayed platelet engraftment，DPE）是影響allo-HSCT 預(yù)后不良的重要因素。目前文獻(xiàn)報道中對于DPE的定義標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，但移植60 d后血小板未植入（血小板計數(shù)＜20×109∕L）或未恢復(fù)（血小板計數(shù)＜50 × 109∕L）均是導(dǎo)致與移植相關(guān)死亡（transplant-related mortality，TRM）的主要因素［1-2］。

非血緣臍血移植（unrelated umbilical cord blood transplantation，UCBT）因原發(fā)疾病復(fù)發(fā)率（relapse incidence，RI）低、慢性移植物抗宿主病發(fā)生率低等優(yōu)點，已是高危惡性血液病allo-HSCT 的主要替代供體來源之一。但與成人供體外周血干細(xì)胞移植（peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT）相比，UCBT后血小板植入（platelet engraftment，PE）明顯延遲，既往文獻(xiàn)報道PE 的中位時間為25（11，653）d，60 d 內(nèi)UCBT 患者的血小板植入率明顯低于PBSCT，術(shù)后血小板輸注需求量增多甚至出血事件增加以及死亡率升高等預(yù)后不良事件，但目前鮮有報道［1-2］。因此單中心回顧性分析UCBT 治療惡性血液病318 例病例DPE 的發(fā)生率、危險因素及其對預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 病 例 資料 自2017年1月1日 至2019年2月28日在我中心接受首次單份臍血移植的318 名患者。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署單份非血緣臍帶血移植書面知情同意書。

1.2 臨床指標(biāo)的定義 以回輸當(dāng)天為0 d 計算。中性粒細(xì)胞植入（neutrophil engraftment，NE）：移植后外周血中性粒細(xì)胞絕對值持續(xù)3 d ≥0.5 × 109∕L的第1 天。PE：移植后脫離血小板輸注連續(xù)7 d 后外周血中血小板絕對值計數(shù)持續(xù)3 d ≥20 × 109∕L的第一天。DPE：UCBT 60 d 后，中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞已植入，血小板絕對值持續(xù)＜20 × 109∕L，或仍然依賴血小板輸注，且排除早期死亡、復(fù)發(fā)和植入失敗等病例［3］。急性移植物抗宿主?。╝cute graftversus-host disease，aGVHD）的診斷和分級依據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)［4］?？笻LA 抗體：通過公司或研究所實驗室，使用Luminex 平臺進(jìn)行測定抗HLA 抗體的存在和滴度，研究中抗HLA-I 類抗體MFI ≥1 000 考慮為陽性［7］。

1.3 預(yù)處理及防治方案

1.3.1 預(yù)處理方案 318 例均采用不含ATG 清髓性預(yù)處理方案：（1）27 例以放療為主：17 例采用TBI∕Ara-C∕CY：全身照射（total body irradiation，TBI）6 Gy∕d，-9、-8 d；+阿糖胞苷（Ara-C）4 g∕m2∕d，-6、-5 d；+環(huán)磷酰胺（Cy）60 mg∕（kg·d），-3、-2 d。10 例采用TMLI∕Flu∕CY：全骨髓聯(lián)合全淋巴照射（total morrow lymphoid irradiation，TMLI）4 Gy∕d，-9、-8、-7 d；+氟達(dá)拉濱（Fludarabine，F(xiàn)lu）50 mg∕m2∕d，-6、-5、-4 d；+CY 60 mg∕kg∕d，-3、-2 d。（2）291 例以化療為主：Flu 30 mg∕m2∕d，-8 ～-5 d；+白消安（Busulfan，Bu）3.2 mg∕kg∕d，-7 ～-4 d（兒童Bu 所用劑量按照歐洲標(biāo)準(zhǔn)［8］）；+CY 60 mg∕kg∕d，-3、-2 d，見圖1。

圖1 預(yù)處理方案流程圖Fig.1 The flowchart of conditioning regimen

1.3.2 預(yù)防aGVHD 方案 均采用環(huán)孢菌素A 聯(lián)合霉酚酸酯預(yù)防aGVHD。采用甲潑尼龍0.5 ～2 mg∕kg∕d 治療aGVHD（Ⅱ-Ⅳ度），隨評估aGVHD緩解情況調(diào)整劑量或增加二線藥物。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 和R 軟件進(jìn)行分析，分類資料采用Pearson χ2檢驗以率表示，連續(xù)性資料采用Mann-WhitneyU檢驗以中位數(shù)（P25，P75）表示，考慮臨床意義，將單因素中P＜0.10 納入logistic 回歸模型進(jìn)行多因素分析。利用Kaplan-Meier 法分析總生存率并使用Log-rank 檢驗；累積函數(shù)法分析累積發(fā)生率。采用Cox 回歸模型對生存指標(biāo)進(jìn)行單因素及多因素分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征 318 例惡性血液病患者進(jìn)行UCBT，年齡16（7，31）歲，體質(zhì)量48（24，61）kg。根據(jù)高分辨率HLA 分型（A、B、Cw 和DRB1）評估供受者HLA 相合程度，139 例為＜6∕8 相合（14 例為4∕8 匹配，125 例為5∕8 匹配），179 例為≥6∕8 相合（118例為6∕8 匹配，47 例為7∕8 匹配，14 例為8∕8 完全匹配）。27 例存在陽性抗HLA-I 類抗體（MFI ＞1 000）但無供者特異性抗體，291 例無或弱陽性抗HLA-I類抗體（0 ≤MFI ≤1 000）。輸注的總有核細(xì)胞（Total nucleated cells，TNC）和CD34+細(xì)胞的中位數(shù)分別為3.12（2.33，4.70）×107∕kg 和1.7（1.21，2.71）×105∕kg（表1）。

表1 318 例患者的基本特征Tab.1 The basic characteristics of 318 patients

2.2 血細(xì)胞植入特征 患者中性粒細(xì)胞均植入，中位NE 時間17（14，21）d，DPE 組和non-DPE 組中分別為21（11，75）d 和16（14，19）d（P＜0.001）。血小板植入病例的中位PE 時間36（29，43）d，DPE組70 例和non-DPE 組248 例病例的中位PE 時間分別為93（69，123）d 和32（13，60）d，DPE 組中35例患者在移植60 d 后PE，33 例在PE 前死亡，2 例在PE 前復(fù)發(fā)。

2.3 UCBT 后并發(fā)癥 318 例患者UCBT 后Ⅱ-Ⅳ度及Ⅲ-Ⅳ度aGVHD 的累積發(fā)生率分別為38.4%（95%CI：33.0% ～43.7%）和31.8%（95%CI：26.7%～36.9%），其中Ⅲ-Ⅳ度aGVHD 累積發(fā)生率在DPE組與non-DPE 組分別為58.6%、24.2%（P= 0.011）。PE前發(fā)生Ⅱ-Ⅳ度和Ⅲ-Ⅳ度aGVHD在DPE組分別為45 例（64.3%）和41 例（58.6%），而non-DPE 組則分別為63 例（25.4%）和46 例（18.5%）。211 例患者在PE 前發(fā)生巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染，其中DPE 組與non-DPE 組分別為62 例（88.6%）和149 例（60.1%）（P＜0.001）。

2.4 DPE 影響因素 在單因素分析中發(fā)現(xiàn)年齡、體質(zhì)量、HLA 等位基因相合程度、TNC、CD34+細(xì)胞數(shù)、CMV 感染、PES 發(fā)生、Ⅱ-Ⅳ度aGVHD 等均與DPE 相關(guān)（P＜0.10）。多因素分析表明HLA 等位基因不合（＜6∕8）（P=0.022），回輸?shù)虲D34+細(xì)胞數(shù)（≤1.7 × 105∕kg）（P= 0.017），PE 前CMV 感染（P=0.002）及Ⅱ-Ⅳ度aGVHD（P＜0.001）均為DPE 的高危因素。見表2。

表2 血小板植入延遲的單因素分析及多因素分析Tab.2 Univariate analysis and multivariate analysis of DPE risk factors 例（%）

2.5 DPE 對預(yù)后影響

2.5.1 總生存率（Overall Survival，OS）及無病生存率（Disease-Free Survival，DFS） 截止隨訪時間2021年8月2日，共205例患者存活，其中DPE 組22 例存活和non-DPE 組183 例存活，中位生存時間1200（1099 ～1405）d。3年OS分別為32.9%（95%CI：22.2% ～43.9%）、74.0%（95%CI：68.0% ～79.1%）（P＜0.001）。3年DFS 分別為32.9%（95%CI：22.2%～43.9%）、68.1%（95%CI：61.9% ～73.5%）（P＜0.001）（圖2-3）。多因素分析提示DPE、體質(zhì)量＞48 kg 及Ⅲ-Ⅳ度aGVHD 是影響OS 和DFS 的危險因素（表3）。

圖2 3年的生存曲線Fig.2 The OS curves at 3 years

2.5.2 TRM 及RI 3年RI為19.2%，DPE 組與non-DPE組分別為10.0%（95%CI：4.3%～18.5%）和21.8%（95%CI：16.9%～27.1%）（P=0.031）。3年TRM 為20.4%，DPE 組和non-DPE 組分別為57.1%（95%CI：44.6% ～67.9%）和10.1%（95%CI：6.7% ～14.2%）（P＜0.001，圖4- 5）。結(jié)果顯示DPE 是TRM 的高危因素（表3）。

表3 預(yù)后的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of outcomes

圖3 3年無病生存曲線Fig.3 The DFS curves at 3 years

圖4 3年的累積復(fù)發(fā)率曲線Fig.4 The cumulative incidence of relapes at 3 years

圖5 3年的移植相關(guān)死亡曲線Fig.5 The cumulative incidence of TRM at 3 years

3 討論

目前國內(nèi)外報道中DPE的發(fā)生率為5%～56%，病因復(fù)雜，具有各研究中心定義、干細(xì)胞來源類型等異質(zhì)性［3］。與TANG 等［5］單倍體異基因造血干細(xì)胞移植10%的發(fā)生率相比，本研究中22.01%的發(fā)生率較高，在相同的定義標(biāo)準(zhǔn)情況下，考慮差異主要來自于不同移植類型的所輸注的造血干細(xì)胞不同，一方面回輸?shù)脑煅杉?xì)胞數(shù)量限制PE 速度，如UCB 中T 細(xì)胞量少，PBSCT 中CD34+細(xì)胞數(shù)量較UCB 高出10 倍左右等；另一方面，UCB 中造血干細(xì)胞的功能，如UCB 中造血干細(xì)胞幼稚等亦是限制臍血移植治療惡性血液疾病的局限［3-7］。

本研究中HLA 不合（＜6∕8）患者發(fā)生DPE 的概率是HLA 相合（≥6∕8）的2.06 倍左右且預(yù)后生存較差，與既往大部分研究相比較一致［8］。如YOKOYAMA 等［9］的研究提及，在臍血移植中不論兒童組還是成人組，HLA 不相合（＜6∕8）會降低血小板植入率，同時降低生存率?；剌?shù)腃D34+細(xì)胞數(shù)升高可顯著提高血小板植入率并加速PE。KONUMA 等［10］對接受臍血移植治療的成年患者（n=316）的研究中提及CD34+劑量與PE相關(guān)，在一定范圍內(nèi)提高CD34+細(xì)胞數(shù)量，血小板植入率可升高1.57 ～2.20 倍，加快PE 速度同時減少移植后血小板輸注量。目前國內(nèi)外有多種針對于改善回輸臍血中CD34+細(xì)胞數(shù)量的方法可開展，如體外擴增干細(xì)胞等，但具體方案有效性尚需進(jìn)一步探索［11］。

研究中發(fā)現(xiàn)PE 前發(fā)生aGVHD 以及CMV 感染是影響血小板植入，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［12］。本研究采用清髓性不含ATG 預(yù)處理方案，DPE 組PE前Ⅱ～Ⅳ度aGVHD的發(fā)生率（64.3%）與CMV感染率（88.6%）仍均較高，考慮病程中CMV感染與aGVHD的免疫抑制治療（immunosuppressive therapy，IST）密切相關(guān)，一方面IST 與UCBT 后T 細(xì)胞免疫重建延緩相關(guān)，另一方面CMV 感染又誘發(fā)aGVHD 的加重，二者均明顯影響PE［13-14］。若無明顯的中、重度aGVHD，適度降低IST 力度，促進(jìn)免疫重建，降低CMV 的激活，可能加速UCBT 血小板植入，但當(dāng)病程中存在重度aGVHD 和CMV 感染，如何平衡IST和抗CMV 感染，仍是臨床棘手的問題。

DPE 患者的生存預(yù)后一般很差，與患者暴露在出血、機會性感染和與移植相關(guān)的死亡的風(fēng)險相關(guān)［15］。目前DPE 發(fā)生機制可如下考慮：（1）骨髓微環(huán)境的異常，骨髓內(nèi)皮細(xì)胞以及趨化因子受損無法為原始細(xì)胞分化提供穩(wěn)定的微環(huán)境；（2）低倍體巨核細(xì)胞增多，成熟分化異常致血小板生成減少；（3）外周血中血小板破壞增加，受者移植后體內(nèi)抗GPⅡb-Ⅲa 抗體增加致使血小板聚集和活化，消耗增加［16］。結(jié)合DPE 機制及臨床特征，目前多種藥物用于促進(jìn)血小板生成，如艾曲波帕、rhTPO 等［17-18］。TANG 等［2］前瞻性研究表明在回輸?shù)虲D34+細(xì)胞數(shù)的UCBT 中使用rhTPO 可增加血小板植入率，但未見明顯加速血小板的早期植入。因此對DPE 的高危因素和機制更具體的了解進(jìn)而保證移植效益具有重要意義。

綜上所述，HLA 配型（＜6∕8），回輸?shù)虲D34+細(xì)胞數(shù)量（≤1.7 × 105∕kg），發(fā)生aGVHD（Ⅱ-Ⅳ度）和CMV 感染被確定為UCBT 后發(fā)生DPE 的高危因素。故在有條件可選擇時，擇優(yōu)選擇臍血供源并在移植過程中盡量預(yù)先避免高危因素，警惕DPE 的發(fā)生，提高患者移植治療的效益保障生存。