潘琪 張旺明 羅非 徐如祥

1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（?？?70102）；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州510280）；3中國科學(xué)院心理研究所（北京100101）；4四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科（成都610072）

帕金森病是一種多見于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)緩慢、肌強(qiáng)直和姿勢步態(tài)障礙為癥狀特征，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性和紋狀體內(nèi)多巴胺嚴(yán)重減少為病理學(xué)特點(diǎn)［1-2］。帕金森病的病理變化引起大腦皮層［3］、基底神經(jīng)節(jié)［4］、丘腦［5］和腦干神經(jīng)核團(tuán)［6］等數(shù)個(gè)區(qū)域的神經(jīng)電活動(dòng)出現(xiàn)改變，包括：神經(jīng)元放電頻率改變、神經(jīng)元放電模式改變和場電位改變等，最終造成了帕金森病的運(yùn)動(dòng)癥狀［7］。其中，帕金森病情況下，有關(guān)丘腦內(nèi)神經(jīng)核團(tuán)的神經(jīng)元放電活動(dòng)的研究相對較少，且研究結(jié)果也并不完全一致［8］。丘腦腹內(nèi)側(cè)核（ventromedial thalamic nucleus，VM）是運(yùn)動(dòng)丘腦的關(guān)鍵核團(tuán)之一，參與構(gòu)成了大腦皮層-基底神經(jīng)節(jié)-丘腦-大腦皮層的運(yùn)動(dòng)環(huán)路［9］。ROLLAND等［10］發(fā)現(xiàn)帕金森病大鼠模型丘腦腹內(nèi)側(cè)核的代謝活動(dòng)明顯減低，這可能反映了丘腦腹內(nèi)側(cè)核電活動(dòng)的降低。但帕金森病條件下丘腦腹內(nèi)側(cè)核的放電活動(dòng)改變?nèi)晕赐耆鞔_。本研究應(yīng)用神經(jīng)元單位放電在體多通道同步記錄方法研究6-羥基多巴胺（6-OHDA）單側(cè)帕金森病模型大鼠丘腦腹內(nèi)側(cè)核的電活動(dòng)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠12 只（購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量250～300 g，自由飲食、飲水，室溫維持在（22 ± 2）℃。所有實(shí)驗(yàn)操作符合南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 試劑與儀器 6-OHDA（H4381）、阿撲嗎啡（apomorphine，APO）（D004）、地昔帕明（D3900）、L-抗壞血酸（A0278）、小鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗 體（T1299）、多 聚 甲 醛（158127）、甲酚紫（114375）購自Sigma-Aldrich 公司。免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（SP-9002）和DAB試劑盒（ZLI-9032）購自北京中杉金橋公司。大鼠腦立體定位儀（51603 型，stoelting 公司），記錄電極（2*4 型，美國東樂公司），神經(jīng)元單位放電在體多通道同步記錄系統(tǒng)（cerebus128 通道系統(tǒng)，美國Blackrock 公司），電生理數(shù)據(jù)分析軟件（NeuroExplorer，美國plexon 公司），電損毀儀（53500 型，Ugo Basile 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)流程 12 只SD 大鼠喂養(yǎng)7 d 以適應(yīng)新環(huán)境；完成大鼠腦部埋置不銹鋼管和記錄電極的手術(shù)；大鼠手術(shù)后恢復(fù)1 周，然后完成建立帕金森病模型前的在體電生理記錄實(shí)驗(yàn)；進(jìn)行大鼠帕金森病模型的制備和鑒定；對成功大鼠模型進(jìn)行在體電生理記錄實(shí)驗(yàn)；電生理記錄實(shí)驗(yàn)完成后，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取腦組織做病理檢查。

1.4 大鼠腦部埋置不銹鋼管和記錄電極手術(shù) 腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg∕kg）麻醉大鼠。將大鼠固定在腦立體定位儀上。參照PAXINOS 等［11］編寫的大鼠腦立體定位圖譜，右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束上方2 mm 處的坐標(biāo)是前囟后2.0 mm、右側(cè)2.0 mm和腹側(cè)6.1 mm，此坐標(biāo)是用于后期注射6-OHDA的不銹鋼管置入端的坐標(biāo)；雙側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核坐標(biāo)是前囟后2.9 mm，左側(cè)或右側(cè)1.4 mm 和大腦皮層下6.9 mm。備皮、常規(guī)消毒，磨開坐標(biāo)點(diǎn)相應(yīng)區(qū)域的顱骨，使用腦立體定位儀將不銹鋼管置入端和記錄電極尖端埋置于相應(yīng)坐標(biāo)處。再用牙科水泥將不銹鋼管和記錄電極固定在大鼠顱骨表面。動(dòng)物手術(shù)后恢復(fù)7 d，然后進(jìn)行在體電生理記錄實(shí)驗(yàn)。

1.5 神經(jīng)元單位放電在體多通道同步記錄 把大鼠放進(jìn)大小為0.4 m × 0.4 m × 0.3 m 的箱中，再把記錄電極連接信號采集芯片，啟動(dòng)神經(jīng)元單位放電在體多通道同步記錄系統(tǒng)，采集動(dòng)作電位。應(yīng)用窗篩法篩選單個(gè)神經(jīng)元放電。對各通道記錄到的神經(jīng)元進(jìn)行篩選后，記錄每個(gè)動(dòng)作電位的時(shí)間點(diǎn)。同時(shí)啟動(dòng)視頻系統(tǒng)，對動(dòng)物的活動(dòng)進(jìn)行錄像。使用Neuroexplorer 電生理數(shù)據(jù)分析軟件離線分析大鼠無肉眼可見活動(dòng)時(shí)的電生理數(shù)據(jù)。對神經(jīng)元平均放電頻率和放電模式進(jìn)行了考察。其中，將神經(jīng)元放電模式分為爆發(fā)放電和非爆發(fā)放電。

1.6 建立帕金森病大鼠模型 大鼠腹腔注射地昔帕明（15 mg∕kg）。0.5 h 后用微量注射器將12 μg∕4 μL 6-OHDA（用含有0.2 %L-抗壞血酸的生理鹽水配置）通過不銹鋼管注入右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束內(nèi)。6-OHDA 注入2 周后，采用APO 誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)測試評價(jià)單側(cè)帕金森病大鼠模型建立情況。對大鼠予皮下注射APO（0.25 mg∕kg）。然后，將大鼠放入半球形容器內(nèi)。給藥10 min 后記錄大鼠向毀損對側(cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)，共記錄0.5 h。成功模型的標(biāo)準(zhǔn)：大鼠向毀損對側(cè)旋轉(zhuǎn)的平均圈數(shù)大于7 圈∕min［12-13］。

1.7 標(biāo)記記錄電極尖端的位置 用8%水合氯醛（腹腔注射，400 mg∕kg）麻醉動(dòng)物。向記錄電極施加20 μA 的陽極直流電，時(shí)長20 s。將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)板上。用37 ℃生理鹽水（300 mL∕只）從左心室快速灌注，再用4%多聚甲醛（含有5%亞鐵氰化鉀，400 mL∕只）灌注。取出鼠腦，并用后者固定6 h。

1.8 黑質(zhì)TH免疫組織化學(xué)染色和神經(jīng)元計(jì)數(shù) 對鼠腦進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為30 μm。按免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書進(jìn)行大鼠中腦組織TH 免疫組織化學(xué)染色。小鼠抗TH 抗體的稀釋比例是1∶1 000。神經(jīng)元數(shù)目計(jì)算方法：取前囟后4.8、5.2、5.6 mm 的切片各1 張，在顯微鏡下對左右兩側(cè)黑質(zhì)的TH 陽性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將3 張切片左右側(cè)神經(jīng)元數(shù)目分別相加，得出每只大鼠單側(cè)黑質(zhì)TH 陽性神經(jīng)元數(shù)目。黑質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元?dú)埓媛室杂覀?cè)黑質(zhì)與左側(cè)黑質(zhì)的TH 陽性神經(jīng)元數(shù)目的百分比表示。

1.9 丘腦腹內(nèi)側(cè)核的甲酚紫染色 對鼠腦進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為40 μm。用0.5 %甲酚紫染色0.5 h。用雙蒸水分化5 min。用梯度酒精脫水；用二甲苯透明切片；最后進(jìn)封片。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 記錄電極尖端在丘腦腹內(nèi)核內(nèi)的成功大鼠模型的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件分析。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。神經(jīng)元平均放電頻率的比較采取重復(fù)測量方差分析。模型建立前和模型建立后的神經(jīng)元放電模式數(shù)據(jù)采取配對χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。雙側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核的神經(jīng)元放電模式數(shù)據(jù)采取成組χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 帕金森病大鼠模型的建立 本研究從12 只大鼠中獲得9 只成功的帕金森病模型大鼠，模型建立的成功率約為75%。模型建立2 周后，成功的模型大鼠皮下注射阿撲嗎啡（0.25 mg∕kg）后出現(xiàn)向毀損對側(cè)快速旋轉(zhuǎn)的行為。模型大鼠的毀損側(cè)黑質(zhì)的TH 陽性神經(jīng)元大量喪失（圖1），神經(jīng)元?dú)埓媛蕿?.1%～13.5%。

圖1 黑質(zhì)TH 免疫組織化學(xué)染色Fig.1 TH immunohistochemical staining of substantia nigra

2.2 記錄電極尖端的解剖位置 大鼠腦立體定位圖譜判斷記錄電極尖端是否在丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)（圖2）。在模型大鼠中，6 個(gè)記錄電極尖端在左側(cè)丘腦腹內(nèi)核內(nèi)，7 個(gè)記錄電極尖端在右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)。全部記錄電極尖端的位置見圖3。

圖2 丘腦腹內(nèi)側(cè)核的甲酚紫染色Fig.2 Cresol purple staining of VM

圖3 記錄電極尖端的位置。Fig.3 Thelocations of electrode tips

2.3 丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元平均放電頻率 本研究在9 只帕金森病模型大鼠的左側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)共有46 個(gè)神經(jīng)元被記錄到，在右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)共有54 個(gè)神經(jīng)元被記錄到。雙側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核在模型建立前和模型建立后的神經(jīng)元平均放電頻率如圖4 所示。模型建立前的左側(cè)和右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的平均放電頻率分別是（14.516 9±0.575 0）Hz 和（15.733 7±0.5360 8）Hz，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 1.547，P= 0.125）。模型建立后的左側(cè)和右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的平均放電頻率分別是（15.528 7 ± 0.572 69）Hz 和（5.698 1 ±0.279 1）Hz，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 15.431，P＜0.001）。和模型建立前比較，模型建立后的右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的平均放電頻率顯著下降（F=306.701，P＜0.001）。和模型建立前比較，模型建立后的左側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的平均放電頻率無顯著變化（F=1.331，P=0.255）。

圖4 丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元平均放電頻率Fig.4 The mean firing rate of neurons in VM

2.4 丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元放電模式 左側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)不同放電模式的神經(jīng)元數(shù)量見表1。模型建立前和模型建立后的神經(jīng)元爆發(fā)放電率分別是21.7%和17.4%。與模型建立前相比，模型建立后的左側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)爆發(fā)放電神經(jīng)元的比例無顯著變化（P= 0.688）。右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)不同放電模式的神經(jīng)元數(shù)量見表2。模型建立前和模型建立后的神經(jīng)元爆發(fā)放電率分別是14.8%和44.4%。與模型建立前相比，模型建立后的右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核爆發(fā)放電神經(jīng)元比例明顯增加（P=0.001）。模型建立前，與左側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核相比較，右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)爆發(fā)放電神經(jīng)元比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.807，P=0.369）。模型建立后，與左側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核相比較，右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)爆發(fā)放電神經(jīng)元比例明顯增加（χ2=8.355，P=0.004）。

表1 左側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)不同放電模式神經(jīng)元的數(shù)量Tab.1 The number of neurons with different discharge patterns in leftVM

表2 右側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)不同放電模式神經(jīng)元的數(shù)量Tab.2 The number of neurons with different discharge patterns in right VM

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)6-OHDA 單側(cè)帕金森病大鼠模型丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的平均放電頻率顯著下降，多數(shù)神經(jīng)元的放電模式發(fā)生改變，爆發(fā)放電神經(jīng)元的比例增加。

本研究利用神經(jīng)元單位放電在體多通道記錄方法，發(fā)現(xiàn)6-OHDA 單側(cè)帕金森病大鼠模型丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的放電頻率減小，該結(jié)果和經(jīng)典的“放電頻率”模型相符合［14］。該模型推測帕金森病患者黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路變性通過直接通路和間接通路引起作為基底神經(jīng)節(jié)輸出核團(tuán)的蒼白球內(nèi)側(cè)部和黑質(zhì)網(wǎng)狀部的神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)。而后兩者向丘腦腹內(nèi)側(cè)核發(fā)出大量利用抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA 的神經(jīng)纖維投射。因此，在帕金森病情況下，蒼白球內(nèi)側(cè)部和黑質(zhì)網(wǎng)狀部的神經(jīng)活動(dòng)出現(xiàn)增強(qiáng)，丘腦腹內(nèi)側(cè)核的神經(jīng)活動(dòng)被抑制，從而表現(xiàn)出神經(jīng)元放電頻率的減小。早期研究發(fā)現(xiàn)帕金森病大鼠模型丘腦腹內(nèi)側(cè)核的代謝活動(dòng)減弱［10，15］，這可能反映了丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元放電活動(dòng)的降低。丘腦腹內(nèi)側(cè)核發(fā)出大量興奮性神經(jīng)纖維分布至大腦皮質(zhì)的多個(gè)部位［16］，在動(dòng)作啟動(dòng)、動(dòng)作選擇和運(yùn)動(dòng)活力的神經(jīng)編碼中起重要作用［17］。丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)活動(dòng)的降低，對大腦皮質(zhì)的活化下降，最后引起帕金森病患者的隨意動(dòng)作減少、動(dòng)作遲緩等表現(xiàn)。有研究報(bào)道高頻率電刺激大鼠黑質(zhì)網(wǎng)狀部可以增加丘腦腹內(nèi)側(cè)核的神經(jīng)元放電頻率，且大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)得到改善［18］；另外，有研究者發(fā)現(xiàn)高頻電刺激帕金森病模型大鼠的束旁核，丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的放電頻率顯著升高［19］。綜合上述結(jié)果，可以推論丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元放電活動(dòng)的下降參與了帕金森病運(yùn)動(dòng)障礙癥狀的發(fā)生機(jī)制，而提高丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元放電活動(dòng)可能改善帕金森病運(yùn)動(dòng)障礙癥狀。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)帕金森病模型大鼠丘腦腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)爆發(fā)放電神經(jīng)元的比例增加。該結(jié)果和使用其他模型進(jìn)行研究的發(fā)現(xiàn)相類似［20-21］。很多研究發(fā)現(xiàn)，作為基底神經(jīng)節(jié)輸出核團(tuán)的黑質(zhì)網(wǎng)狀部和蒼白球內(nèi)側(cè)部神經(jīng)元的放電模式在帕金森病條件下出現(xiàn)了顯著變化，更多的神經(jīng)元轉(zhuǎn)變成爆發(fā)式放電［22］。這種電活動(dòng)的變化可能通過黑質(zhì)網(wǎng)狀部和蒼白球內(nèi)側(cè)部向丘腦腹內(nèi)側(cè)核發(fā)出的神經(jīng)纖維傳導(dǎo)至后者。目前，帕金森病時(shí)這種神經(jīng)元放電模式的變化和運(yùn)動(dòng)癥狀的關(guān)系尚未闡明清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森病模型中，丘腦腹內(nèi)側(cè)核出現(xiàn)同步化的神經(jīng)元活動(dòng)，而這種改變促進(jìn)了整個(gè)基底神經(jīng)核-丘腦-皮層網(wǎng)絡(luò)的高β 振蕩的出現(xiàn)，而后者被認(rèn)為是導(dǎo)致帕金森病運(yùn)動(dòng)癥狀的關(guān)鍵神經(jīng)電活動(dòng)改變［23］。

6-OHDA 單側(cè)帕金森病大鼠模型是一種常用的帕金森病動(dòng)物模型，能夠部分模擬出帕金森病的病理改變和臨床癥狀［24］。其中，將較大劑量的6-OHDA 注射入大鼠一側(cè)的內(nèi)側(cè)前腦束能夠嚴(yán)重毀損一側(cè)黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和紋狀體多巴胺能神經(jīng)纖維大量喪失，大鼠表現(xiàn)出明顯運(yùn)動(dòng)障礙行為，類似中晚期帕金森病患者的病理改變和運(yùn)動(dòng)癥狀。通過這種方法建立的單側(cè)帕金森病模型在帕金森病電生理研究中被廣泛應(yīng)用［25］。單側(cè)帕金森病模型僅一側(cè)黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路被損毀，而另一側(cè)通路仍然完好，后者被認(rèn)為是良好的內(nèi)部參照物。本研究也確實(shí)發(fā)現(xiàn)健側(cè)丘腦腹內(nèi)側(cè)核在模型建立前和模型建立后的電活動(dòng)無顯著變化。有研究報(bào)道，生物的覺醒水平影響神經(jīng)系統(tǒng)的電活動(dòng)，而帕金森病能夠?qū)е律锏挠X醒水平發(fā)生變化［26］。為了排除帕金森病模型建立后，大鼠的覺醒水平的改變對神經(jīng)元電活動(dòng)變化的影響，本研究比較了健側(cè)和毀損側(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。為了排除一側(cè)毀損對另一側(cè)核團(tuán)的電活動(dòng)的影響，本研究又對模型建立前和模型建立后的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。同時(shí)使用這兩種分析方法，在一定程度上提高了研究結(jié)果的可信度。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)6-OHDA 單側(cè)帕金森病模型大鼠丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元放電頻率下降，且爆發(fā)放電神經(jīng)元比例增加，丘腦腹內(nèi)側(cè)核可能在帕金森病的病理生理機(jī)制中扮演重要角色。